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专利名称：富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210998856.7

专利申请（专利权）人：吉林省拓华生物开云优惠体育网页版入口有限公司
权利人地址：吉林省四平市铁东区石岭镇塔子沟村

专利发明（设计）人：发明人:姜丽君,贲亮,李超

专利摘要：本发明公开一种富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法及其应用，该方法包括以下步骤血小板裂解物的提。唤涸鞍椎奶崛。簧锬旱纳。本发明的技术方案采用脐血源血小板，其具有低免疫原性和通用性，可以广泛应用，且脐血源血小板裂解物可以实现批量收集、批量制备、批量检测，实现质量可控的生产工艺；通过脐带组织提取得到的胶原蛋白与其它具有免疫原性的蛋白质相比，其免疫原性非常低，且理化性质稳定，具有出色的营养特性与加工性能，在生物医学材料、化妆品、食品、保健品领域均具有广泛应用；通过脐血源血小板制备得到的血小板裂解物和通过脐带组织提取得到的胶原蛋白，用于制备的生物凝胶，降低了生物凝胶的免疫的排斥性。

主权利要求：
1.一种富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）血小板裂解物的提取
脐带血置于离心管中离心处理，收集血细胞沉淀；
加入等体积的羟乙基淀粉注射液，混匀并离心处理，收集上清液，标记为PLT?1，并收集剩余血液；
向剩余血液中加入等体积的PBS，混匀，加入淋巴细胞分离液，离心处理；
收集PBMC层上面的澄清层于PLT?1中，收集PBMC层于新的离心管中；
将PBS加入到PBMC层中，混匀，离心洗涤；收集上层洗液，标记为PLT?2；
混匀PLT?1和PLT?2中的血小板，离心处理，收集离心沉淀，加入PBS悬浮处理；
反复冻融处理3次，离心处理，收集上清液；
过滤处理，离心处理，弃上清，加入透明质酸钠水溶液悬浮沉淀，得血小板裂解液；
（2）胶原蛋白的提取
从脐带组织中分离出Wharton胶，PBS清洗2遍；
加入含胶原酶和透明质酸的消化酶，摇晃反应；
加入等体积的胰蛋白酶，摇晃反应；
将反应物离心处理，收集上清液；
向上清液中加入氯化钠溶液，静置盐析30min后，离心处理，得离心沉淀；
加入50%的透明质酸水溶液悬浮离心沉淀，得胶原蛋白；
（3）生物凝胶的生成
收集悬浮的血小板裂解液和胶原蛋白，并加入8%甘露醇，混匀；
冷冻干燥，钴60辐射灭菌，得到生物凝胶；
所述脐带血置于离心管中离心处理，收集血细胞沉淀的步骤的离心条件：离心机的转速为2000rpm，离心时间为10min；
所述加入等体积的羟乙基淀粉注射液，混匀并离心处理，收集上清液，标记为PLT?1，并收集剩余血液的步骤的离心条件：离心机的离心力为250g，离心时间为20min；
所述向剩余血液中加入等体积的PBS，混匀，加入淋巴细胞分离液，离心处理的步骤的离心条件：离心机的离心力为800g，离心时间为20min；
所述将PBS加入到PBMC层中，混匀，离心洗涤；收集上层洗液，标记为PLT?2的步骤的离心条件：离心机的离心力为400g，离心时间为10min；
所述混匀PLT?1和PLT?2中的血小板，离心处理，收集离心沉淀，加入PBS悬浮处理的步骤的离心条件：离心机的离心力为2000g，离心时间为10min；
所述反复冻融处理3次，离心处理，收集上清液的步骤的离心条件：离心机的离心力为
2000g，离心时间为10min；
所述过滤处理，离心处理，弃上清，加入透明质酸钠水溶液悬浮沉淀，得血小板裂解液的步骤的离心条件：离心机的离心力为12000g，离心时间为20min；
所述将反应物离心处理，收集上清液的步骤包括：将反应物置于离心速率为1500rpm的离心机中，离心10min，收集上清液至新的离心管内；
所述向上清液中加入氯化钠溶液，静置盐析30min后，离心处理，得离心沉淀的步骤包括：向上清液中加入5mol/L的氯化钠溶液，静置盐析30min，放置于离心速率为6000r/min的离心机中离心20min。
2.根据权利要求1所述的富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法，其特征在于，所述反复冻融处理3次，离心处理，收集上清液的步骤包括：?80℃冻存悬浮沉淀，24h后，37℃复苏10min；反复冻融三次；
将复苏后的悬浮液进行离心处理，收集上清液。
3.根据权利要求1所述的富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法，其特征在于，所述过滤处理，离心处理，弃上清，加入透明质酸钠水溶液悬浮沉淀，得血小板裂解液的步骤包括：将上清液进行0.22um过滤；
过滤后的上清液置于离心机中离心处理；
收集离心沉淀，并用50%的透明质酸钠水溶液悬浮离心沉淀，得血小板裂解液。
4.根据权利要求1所述的富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法，其特征在于，所述加入含胶原酶和透明质酸的消化酶，摇晃反应的步骤包括：加入含0.2%I型胶原酶和0.01%透明质酸的消化酶；37℃消化反应4h；
消化反应后，不断摇晃至溶液粘稠。
5.根据权利要求4所述的富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法，其特征在于，所述加入等体积的胰蛋白酶，摇晃反应的步骤包括：加入0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化反应20min，并不断摇晃；
将溶液置于两个注射器中，采用鲁尔连接的方式连接，反复推拉20次?30次，至溶液不粘稠。
6.根据权利要求1所述的富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥，钴60辐射灭菌，得到生物凝胶的步骤包括：冷冻干燥36小时?48小时，温度变化范围为?50℃?35℃，每小时升温1℃?2℃，真空度
6Pa?4Pa；
封口，钴60辐射灭菌，得到生物凝胶。
7.根据如上权利要求1至6中任一项所述的富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法制备得到的生物凝胶在制备用于伤口愈合或疤痕修复的药物中的用途。 说明书 : 富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法及其
应用技术领域[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法及其应用。背景技术[0002] 血小板是血液中的有形成分之一，其主要功能是通过粘附、聚集和释放反应参与机体的生理性止血，促进凝血和维持内皮细胞的完整性等，血小板不仅在止血和凝血中发挥作用而且在创伤修复促进血管形成和炎症过程中发挥着重要作用。血小板经凝血酶钙剂激活后的释放物和反复冻融后裂解物富含多种生长因子，包括血小板原性生长因子（PDGF）、转化生长因子（TGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）等，血小板的应用方式多样，主要有PRP直接注射、制作血小板凝胶（PG）使用、提取PG上清使用、促进干细胞生长等，不同的制备方法获得血小板成分作为局部生长因子的来源，可以封闭创面、加速凝血止血、缩短手术时间、缓和炎症、减轻疼痛、促进组织再生修复。己经广泛地应用于医学领域，包括牙科、口腔种植、整形外科、溃疡、骨科、组织工程和运动医学等。[0003] 目前血小板裂解物多源于成体自体外周血，其产能和功能均具有一定的局限性，不同个体差异较大，易发生排斥反应及不良反应。[0004] 胶原蛋白是天然的高分子蛋白质，是多细胞生物体内分布最广，含量最多的功能性蛋白质，在人体中约占体重的6%，占总蛋白质的25%～30%。具有良好的理化性能，普遍存在于动物的结缔组织中，是皮肤的支持组织，可保持皮肤细腻，增强弹性并提高细胞的储水能力，有极好的生物降解性。胶原作为医用生物材料，最重要的特点在于其低免疫原性，与其它具有免疫原性的蛋白质相比，胶原蛋白的免疫原性非常低。人们甚至曾认为胶原不具有抗原性。胶原蛋白理化性质稳定，具有出色的营养特性与加工性能，在生物医学材料、化妆品、食品、保健品领域均具有广泛应用。[0005] 胶原蛋白制品多为异种来源，如水产品，牛骨等，人源化的胶原蛋白产品少之又少。[0006] 导致目前的由血小板和胶原蛋白制成的生物凝胶产品具有易发生免疫性排斥的缺点。[0007] 综上所述，如何降低生物凝胶的免疫排斥性；是目前本领域技术人员亟待解决的问题。发明内容[0008] 本发明实施例的主要目的在于提出一种富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法，旨在提供一种新型的生物凝胶制备方法，采用脐带组织和脐带血为原材料，以降低生物凝胶的免疫排斥性。[0009] 本发明解决上述技术问题的技术方案是，提供一种富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：[0010] （1）血小板裂解物的提取[0011] 脐带血置于离心管中离心处理，收集血细胞沉淀；[0012] 加入等体积的羟乙基淀粉注射液，混匀并离心处理，收集上清液，标记为PLT?1，并收集剩余血液；[0013] 向剩余血液中加入等体积的PBS，混匀，加入上淋巴细胞分离液，离心处理；[0014] 收集PBMC层上面的澄清层于PLT?1中，收集PBMC层于新的离心管中；[0015] 将PBS加入到PBMC层中，混匀，离心洗涤；收集上层洗液，标记为PLT?2；[0016] 混匀PLT?1和PLT?2中的血小板，离心处理，收集离心沉淀，加入PBS悬浮处理；[0017] 反复冻融处理3次，离心处理，收集上清液；[0018] 过滤处理、离心处理，弃上清，加入透明质酸钠水溶液悬浮沉淀，得血小板裂解液；[0019] （2）胶原蛋白的提取[0020] 从脐带组织中分离出Wharton胶，PBS清洗2遍；[0021] 加入含胶原酶和透明质酸的消化酶，摇晃反应；[0022] 加入等体积的胰蛋白酶，摇晃反应；[0023] 将反应物离心处理，收集上清液；[0024] 向上清液中加入氯化钠溶液，静置盐析30min后，离心处理，得离心沉淀；[0025] 加入50%的透明质酸水溶液悬浮离心沉淀，得胶原蛋白；[0026] （3）生物凝胶的生成[0027] 收集悬浮的血小板裂解液和胶原蛋白，并加入8%甘露醇，混匀；[0028] 冷冻干燥，钴60辐射灭菌，得到生物凝胶。[0029] 在本发明一实施例中，所述脐带血置于离心管中离心处理，收集血细胞沉淀的步骤的离心条件：离心机的转速为2000rpm，离心时间为10min；和/或[0030] 所述加入等体积的羟乙基淀粉注射液，混匀并离心处理，收集上清液，标记为PLT?1，并收集剩余血液的步骤的离心条件：离心机的离心力为250g，离心时间为20min；和/或[0031] 所述向剩余血液中加入等体积的PBS，混匀，加入上淋巴细胞分离液，离心处理的步骤的离心条件：离心机的离心力为800g，离心时间为20min；和/或[0032] 所述将PBS加入到PBMC层中，混匀，离心洗涤；收集上层洗液，标记为PLT?2的步骤的离心条件：离心机的离心力为400g，离心时间为10min；和/或[0033] 所述混匀PLT?1和PLT?2中的血小板，离心处理，收集离心沉淀，加入PBS悬浮处理的步骤的离心条件：离心机的离心力为2000g，离心时间为10min；和/或[0034] 所述反复冻融处理3次，离心处理，收集上清液的步骤的离心条件：离心机的离心力为2000g，离心时间为10min；和/或[0035] 所述过滤处理、离心处理，弃上清，加入透明质酸钠水溶液悬浮沉淀，得血小板裂解液的步骤的离心条件：离心机的离心力为12000g，离心时间为20min。[0036] 在本发明一实施例中，所述反复冻融处理3次，离心处理，收集上清液的步骤包括：[0037] ?80℃冻存悬浮沉淀，24h后，37℃复苏10min；反复冻融三次；[0038] 将复苏后的悬浮液进行离心处理，收集上清液。[0039] 在本发明一实施例中，所述过滤处理、离心处理，弃上清，加入透明质酸钠水溶液悬浮沉淀，得血小板裂解液的步骤包括：[0040] 将上清液进行0.22um过滤；[0041] 过滤后的上清液置于离心机中离心处理；[0042] 收集离心沉淀，并用50%的透明质酸钠水溶液悬浮离心沉淀，得血小板裂解液。[0043] 在本发明一实施例中，所述从脐带组织中分离出Wharton胶，PBS清洗2遍的步骤包括：[0044] 采用PBS充分洗涤脐带组织，洗去残留的血液，去除静脉、动脉及脐带外模，分离出Wharton胶；[0045] 将Wharton胶剪碎至0.5mm3至2mm3，并用PBS清洗两遍。[0046] 在本发明一实施例中，所述加入含胶原酶和透明质酸的消化酶，摇晃反应的步骤包括：[0047] 加入含0.2%I型胶原酶和0.01%透明质酸的消化酶；37℃消化反应4h；[0048] 消化反应后，不断摇晃至溶液粘稠。[0049] 在本发明一实施例中，所述加入等体积的胰蛋白酶，摇晃反应的步骤包括：[0050] 加入0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化反应20min，并不断摇晃；[0051] 将溶液置于两个注射器中，采用鲁尔连接的方式连接，反复推拉20次?30次，至溶液不粘稠。[0052] 在本发明一实施例中，所述将反应物离心处理，收集上清液的步骤包括：[0053] 将反应物置于离心速率为1500rpm的离心机中，离心10min，收集上清液至新的离心管内；[0054] 其中，离心沉淀物，采用干细胞培养基悬浮离心沉淀物，混匀细胞沉淀接种于培养瓶内，可用于脐带源间充质干细胞的培养。[0055] 在本发明一实施例中，所述向上清液中加入氯化钠溶液，静置盐析30min后，离心处理，得离心沉淀的步骤包括：[0056] 向上清液中加入5mol/L的氯化钠溶液，静置盐析30min；[0057] 放置于离心速率为6000r/min的离心机中离心20min。[0058] 在本发明一实施例中，所述冷冻干燥，钴60辐射灭菌，得到生物凝胶的步骤包括：[0059] 冷冻干燥36小时?48小时，温度变化范围为?50℃?35℃，每小时升温1℃?2℃，真空度6Pa?4Pa；[0060] 封口，钴60辐射灭菌，得到生物凝胶。[0061] 根据如上所述的富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法制备得到的生物凝胶在制备用于伤口愈合、疤痕修复或美容的药物中的用途。[0062] 本发明的技术方案，采用脐血源血小板，其具有低免疫原性和通用性，可以广泛应用，且脐血源血小板裂解物可以实现批量收集、批量制备、批量检测，实现质量可控的生产工艺；通过脐带组织提取得到的胶原蛋白与其它具有免疫原性的蛋白质相比，其免疫原性非常低，且理化性质稳定，具有出色的营养特性与加工性能，在生物医学材料、化妆品、食品、保健品领域均具有广泛应用；通过脐血源血小板制备得到的血小板裂解物和通过脐带组织提取得到的胶原蛋白，用于制备的生物凝胶，降低了生物凝胶的免疫的排斥性。附图说明[0063] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。[0064] 图1为本发明所述血小板裂解物的制备流程示意图；[0065] 图2为本发明所述胶原蛋白的提取的制备流程示意图；[0066] 图3为本发明所述生物凝胶的制备流程示意图；[0067] 图4为本发明ELISA检测实施例1制备得到的血小板裂解物中PDGF、IGF、EGF、FGF、HGF的含量的示意图；[0068] 图5为本发明胶原蛋白的紫外吸收光谱。具体实施方式[0069] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0070] 需要说明，本发明实施例中所有方向性指示（诸如上、下、左、右、前、后……）仅用于解释在某一特定姿态（如附图所示）下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。[0071] 另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“若干”、“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。[0072] 在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“连接”、“固定”等应做广义理解，例如，“固定”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。[0073] 另外，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基。奔际醴桨傅慕岷铣鱿窒嗷ッ芑蛭薹ㄊ迪质庇Φ比衔庵旨际醴桨傅慕岷喜淮嬖，也不在本发明要求的保护范围之内。[0074] 生物材料的筛选及采集：[0075] （1）确认产妇无病毒感染、无遗传性疾病或其他重大疾病等，填写知情同意书。[0076] （2）无菌手术室环境下，采集脐带血（100 120ml）及脐带组织（20 30cm），分别置于~ ~无菌采血袋和无菌储存盒内。[0077] （3）冷链运输至净化实验内，运输时间控制在8小时以内。[0078] 本发明提出一种富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法，旨在提供一种新型的生物凝胶制备方法，采用脐带组织和脐带血为原材料，以降低生物凝胶的免疫排斥性。[0079] 下面将在具体实施例中对本发明提出的富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法进行说明：[0080] 在本实施例的技术方案中，一种富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：[0081] 如图1所示，S10血小板裂解物的提。籟0082] S11：脐带血置于离心管中离心处理，收集血细胞沉淀；[0083] 可以理解地，脐带血置于50ml的离心管中，并放入离心机中，离心机的离心条件为：转速为2000rpm，离心时间为10min，分层后，取下层的到血细胞沉淀。取上层的血浆，血浆可冻存，也可用于细胞培养使用。[0084] S12：加入等体积的羟乙基淀粉注射液，混匀并离心处理，收集上清液，标记为PLT?1，并收集剩余血液；[0085] 可以理解地，向血细胞沉淀中加入等体积的羟乙基淀粉注射液，摇匀血细胞沉淀和羟乙基淀粉注射液，摇匀后放入离心机中，离心机的离心力为250g，离心20min。[0086] S13：向剩余血液中加入等体积的PBS，混匀，加入上淋巴细胞分离液，离心处理；[0087] 可以理解地，收集上清液后的剩余血液加入等体积PBS，将PBS和剩余血液混匀，加入上淋巴细胞分离液，放入离心机中进行离心处理，离心机的离心力为800g，离心20min。[0088] S14：收集PBMC层上面的澄清层于PLT?1中，收集PBMC层于新的离心管中；[0089] 可以理解地，离心20min后，收集PBMC层上面的澄清层于PLT?1中，收集PBMC层于新的离心管中，以备使用。[0090] S15：将PBS加入到PBMC层中，混匀，离心洗涤；收集上层洗液，标记为PLT?2；[0091] 可以理解地，将PBS加入到含有PBMC的离心管中，混匀后，放入离心机中，离心力为400g，离心洗涤10min，离心洗涤2遍，收集上层洗液，标记为PLT?2；[0092] S16：混匀PLT?1和PLT?2中的血小板，离心处理，收集离心沉淀，加入PBS悬浮处理；[0093] 可以理解地，混匀PLT?1和PLT?2，并放入离心机中离心处理，离心机的离心力为2000g，离心10min；离心处理后，收集离心沉淀，向离心沉淀中加入PBS进行悬浮处理。[0094] S17：反复冻融处理3次，离心处理，收集上清液；[0095] 可以理解地，反复冻融处理3次后，离心处理，离心力为2000g，离心时间为10min。[0096] S18：过滤处理、离心处理，弃上清，加入透明质酸钠水溶液悬浮沉淀，得血小板裂解液。[0097] 可以理解地，离心后的上清液经过过滤处理，再次离心处理，离心机的离心力为12000g，离心时间为20min，弃上清，加入4ml的50%透明质酸钠水溶液悬浮沉淀；得血小板裂解液。[0098] 如图2所示，S20胶原蛋白的提。籟0099] S21：从脐带组织中分离出Wharton胶，PBS清洗2遍；[0100] S22：加入含胶原酶和透明质酸的消化酶，摇晃反应；[0101] S23：加入等体积的胰蛋白酶，摇晃反应；[0102] S24：将反应物离心处理，收集上清液；[0103] S25：向上清液中加入氯化钠溶液，静置盐析30min后，离心处理，得离心沉淀；[0104] S26：加入50%的透明质酸水溶液悬浮离心沉淀，得胶原蛋白。[0105] 如图3所示，S30生物凝胶的生成。[0106] S31：收集悬浮的血小板裂解液和胶原蛋白，并加入8%甘露醇，混匀；[0107] S32：冷冻干燥，钴60辐射灭菌，得到生物凝胶。[0108] 可以理解地，脐带是连于胚胎脐部与胎盘间的索状结构，脐带血管周围被粘蛋白样组织所包裹，被称为Wharton胶。对脐带组织进行组织化学和免疫组织化学染色发现，脐带组织番红“0”和甲苯胺蓝染色均为阳性，I、II型胶原和aggrecan免疫组织化学染色均为阳性，证明脐带组织中富含氨基多糖、蛋白多糖和胶原成分。候克东等研究证明Wharton组织中的胶原成分和GAGs分别占脐带Wharton胶湿重的0.346%和0.304%。胶原和GAGs是软骨组织的重要基质成分，免疫原性低，不会诱发免疫排斥反应。且其都属医疗废弃物，取材方便，来源丰富，更无伦理学问题。本专利采用脐血源血小板，其具有低免疫原性和通用性，可以广泛应用，且脐血源血小板裂解物可以实现批量收集、批量制备、批量检测，实现质量可控的生产工艺，通过脐血源血小板制备得到的血小板裂解物，用于制备的生物凝胶降低了生物凝胶的免疫的排斥性。[0109] 在本发明一实施例中，步骤S17包括：[0110] S171：?80℃冻存悬浮沉淀，24h后，37℃复苏10min；反复冻融三次；[0111] S172：将复苏后的悬浮液进行离心处理，收集上清液。[0112] 在本发明一实施例中，步骤S18包括：[0113] S181：将上清液进行0.22um过滤；[0114] S182：过滤后的上清液置于离心机中离心处理；[0115] S183：收集离心沉淀，并用50%的透明质酸钠水溶液悬浮离心沉淀，得血小板裂解液。[0116] 在本发明一实施例中，步骤S21包括：[0117] S211：采用PBS充分洗涤脐带组织，洗去残留的血液，去除静脉、动脉及脐带外模，分离出Wharton胶；[0118] S212：将Wharton胶剪碎至0.5mm3至2mm3，并用PBS清洗两遍。[0119] 在本发明一实施例中，步骤S22包括：[0120] S221：加入含0.2%I型胶原酶和0.01%透明质酸的消化酶；37℃消化反应4h；[0121] S222：消化反应后，不断摇晃至溶液粘稠。[0122] 在本发明一实施例中，步骤S23包括：[0123] S231：加入0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化反应20min，并不断摇晃；[0124] S232：将溶液置于两个注射器中，采用鲁尔连接的方式连接，反复推拉20次?30次，至溶液不粘稠。[0125] 在本发明一实施例中，步骤S24包括：[0126] S241：将反应物置于离心速率为1500rpm的离心机中，离心10min，收集上清液至新的离心管内；[0127] 其中，离心沉淀物，采用干细胞培养基悬浮离心沉淀物，混匀细胞沉淀接种于培养瓶内，可用于脐带源间充质干细胞的培养。[0128] 在本发明一实施例中，步骤S25包括：[0129] S251：向上清液中加入5mol/L的氯化钠溶液，静置盐析30min；[0130] S252：放置于离心速率为6000r/min的离心机中离心20min。[0131] 在本发明一实施例中，步骤S32包括：[0132] S321：冷冻干燥36小时?48小时，温度变化范围为?50℃?35℃，每小时升温1℃?2℃，真空度6Pa?4Pa；[0133] S322：封口，钴60辐射灭菌，得到生物凝胶。[0134] 根据如上所述的富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法制备得到的生物凝胶在制备用于伤口愈合、疤痕修复或美容的药物中的用途。[0135] 实施例1：（1）血小板裂解物的提取[0136] 将脐带血置于50ml的离心管中，并放入离心机中，离心机的离心条件为：转速为2000rpm，离心时间为10min，分层后，取下层的到血细胞沉淀。[0137] 向血细胞沉淀中加入等体积的羟乙基淀粉注射液，摇匀血细胞沉淀和羟乙基淀粉注射液，摇匀后放入离心机中，离心机的离心力为250g，离心20min；[0138] 收集上清液后的剩余血液加入等体积PBS，将PBS和剩余血液混匀，加入上淋巴细胞分离液，放入离心机中进行离心处理，离心机的离心力为800g，离心20min；[0139] 离心20min后，收集PBMC层上面的澄清层于PLT?1中，收集PBMC层于新的离心管中，以备使用；[0140] 将PBS加入到含有PBMC的离心管中，混匀后，放入离心机中，离心力为400g，离心洗涤10min，离心洗涤2遍，收集上层洗液，标记为PLT?2；[0141] 混匀PLT?1和PLT?2，并放入离心机中离心处理，离心机的离心力为2000g，离心10min；离心处理后，收集离心沉淀，向离心沉淀中加入PBS进行悬浮处理；[0142] ?80℃冻存悬浮沉淀，24h后，37℃复苏10min；反复冻融三次，将复苏后的悬浮液进行离心处理，离心力为2000g，离心时间为10min，收集上清液；[0143] 离心后的上清液经过0.22um的过滤处理，再次离心处理，离心机的离心力为12000g，离心时间为20min，弃上清，加入4ml的50%透明质酸钠水溶液悬浮沉淀；得血小板裂解液。[0144] （2）胶原蛋白的提取[0145] 采用PBS充分洗涤脐带组织，洗去残留的血液，去除静脉、动脉及脐带外模，分离出Wharton胶；[0146] 将Wharton胶剪碎至0.5mm3至2mm3，并用PBS清洗两遍；[0147] 加入含0.2%I型胶原酶和0.01%透明质酸的消化酶；37℃消化反应4h；[0148] 消化反应后，不断摇晃至溶液粘稠；[0149] 加入0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化反应20min，并不断摇晃；[0150] 将溶液置于两个注射器中，采用鲁尔连接的方式连接，反复推拉20次?30次，至溶液不粘稠；[0151] 将反应物置于离心速率为1500rpm的离心机中，离心10min，收集上清液至新的离心管内；[0152] 向上清液中加入5mol/L的氯化钠溶液，静置盐析30min；[0153] 放置于离心速率为6000r/min的离心机中离心20min。[0154] 加入50%的透明质酸水溶液悬浮离心沉淀，得胶原蛋白。[0155] （3）生物凝胶的生成[0156] 收集悬浮的血小板裂解液和胶原蛋白，并加入8%甘露醇，混匀；[0157] 冷冻干燥36小时?48小时，温度变化范围为?50℃?35℃，每小时升温1℃?2℃，真空度6Pa?4Pa；[0158] 封口，钴60辐射灭菌，得到生物凝胶。[0159] 采用ELISA检测实施例1制备得到的血小板裂解物中PDGF、IGF、EGF、FGF、HGF的含量：[0160] 1.采集三份健康志愿者的生物标本，脐带血100ml。[0161] 2.采用实施例1的制备方式制得血小板裂解物，采用4ml超纯水溶解，1小时之内检测生长因子的浓度；[0162] 3.按酶联免疫分析试剂盒的说明书操作进行，标准品和样本都设定4个复孔，每孔加入标准品和检测样本各100?1到96孔板中，37℃孵育2h，充分结合；[0163] 4.用PBST洗板4遍，每孔加入100?lHRP标记的生长因子抗体，37℃孵育2h；[0164] 5.加底物TMB转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色，颜色的深浅和样品中的生长因子浓度呈正相关；[0165] 6.以标准品浓度为横坐标，以相应的A值为纵坐标，绘制标准曲钱，将450nm波长处A值代入标准曲线，由标准曲线换算出相应的样品浓度。[0166] 结果显示：如图4所示，血小板裂解物中含有多种细胞因子，HGF含量最高，PDGF和FGF次之，IGF和EGF较低。[0167] 对实施例1制备的胶原蛋白，进行紫外吸收光谱分析[0168] 1.采集三份健康志愿者的生物标本脐带组织（20 30cm）。~[0169] 2.实施例1的制备方法制备提取得到的胶原蛋白，采用4ml超纯水溶液悬浮沉淀。[0170] 3.打开紫外?可见光分光光度计，参数设置；[0171] 4.校准基线：空白样品（水）放到比色槽内，点击“基线”键，进行基线校准；[0172] 5.样本测试：将脐带源胶原蛋白样本溶液移入比色皿（大约2/3处），放到比色槽中，点击“开始”键，进行扫描，保存。[0173] 结果显示：如图5所示，提取的胶原蛋白样本均在235nm附近有明显的吸收峰，符合Ⅰ型胶原蛋白的紫外吸收。但除了230nm附近的吸收峰外，280nm波长处吸收紫外线也存在明显吸收峰，说明提取的胶原蛋白溶液中含部分杂蛋白，但以胶原蛋白为主。[0174] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

专利地区：吉林

专利申请日期：2022-08-19

专利公开日期：2024-10-11

专利公告号：CN115337261B