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专利名称：一种提升水稻苗期高温耐受性的基因OsHTG8及其编码蛋白和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202311364191.5

专利申请（专利权）人：四川农业大学
权利人地址：四川省雅安市雨城区新康路46号

专利发明（设计）人：发明人:袁华,许正艳,刘洋,周小蓉,钦鹏,李仕贵,王玉平,马炳田,陈薇兰,涂斌

专利摘要：本发明公开了一种提升水稻苗期高温耐受性的基因OsHTG8及其编码蛋白和应用，属于基因工程技术领域。基因OsHTG8的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。基因OsHTG8参与水稻苗期高温胁迫响应，正调控苗期高温耐受性，为改良水稻苗期高温耐受性和研究水稻高温耐受性分子机制提供了新的基因资源。

主权利要求：
1.基因OsHTG8或基因OsHTG8编码的蛋白或包含基因OsHTG8的表达载体在提升水稻苗期高温耐受性方面的应用；其中，基因OsHTG8的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，基因OsHTG8编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
2.基因OsHTG8或基因OsHTG8编码的蛋白或包含基因OsHTG8的表达载体在水稻高温耐受性改良中的应用；其中，基因OsHTG8的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，基因OsHTG8编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.基因OsHTG8或基因OsHTG8编码的蛋白或包含基因OsHTG8的表达载体在培育具有高温耐受性的水稻品种或水稻耐高温种质资源改良中的应用；其中，基因OsHTG8的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，基因OsHTG8编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。 说明书 : 一种提升水稻苗期高温耐受性的基因OsHTG8及其编码蛋白和
应用技术领域[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种提升水稻苗期高温耐受性的基因OsHTG8及其编码蛋白和应用。背景技术[0002] 水稻是全球重要的粮食作物之一，为世界超一半以上的人口提供口粮。近年来，高温天气频发，温室效应加剧，高温胁迫已成为影响水稻稳产的主要障碍之一，高温会导致水稻减产。高温胁迫主要通过损害光合活性，改变质膜流动性，影响蛋白质稳定性，积累过多的活性氧，并改变植物激素的产生和信号传导等导致植物产生应激反应，进而损害植物生长及发育。这些过程往往都是由一些基因调控，这些基因主要涉及热激蛋白家族、转录因子类、各种酶类等。因此，挖掘高温响应相关基因，有助于解析水稻与高温相关的分子机制，培育耐高温新品种。[0003] 迄今为止，已鉴定了许多高温相关QTL，但仅克隆其中少数几个，包括OsTT1、OsTT2、HTH5、OsTT3.1和OsTT3.2等。此外，研究者通过不同遗传材料也克隆了一些其它高温相关基因，包括HTG3、SLG1、OsEDS1、OsbZIP58、OsbZIP14、OsCNGC14和OsCNGC16等。尽管已经有许多高温相关基因被报道克。商嵘久缙诟呶履褪苄缘幕騉sHTG8还未见报道。发明内容[0004] 为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种提升水稻苗期高温耐受性的基因OsHTG8及其编码蛋白和应用，该基因参与水稻苗期高温胁迫响应，正调控苗期高温耐受性，为改良水稻苗期高温耐受性和研究水稻高温耐受性分子机制提供了新的基因资源。[0005] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：[0006] 本发明的第一个目的是提供一种提升水稻苗期高温耐受性的基因OsHTG8，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。[0007] 本发明的第二个目的是提供上述基因OsHTG8编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。[0008] 本发明的第三个目的是提供一种表达载体，该表达载体包括上述基因OsHTG8。[0009] 本发明的第四个目的是提供上述基因OsHTG8或其编码的蛋白或含有基因OsHTG8的表达载体在提升水稻苗期高温耐受性方面的应用。[0010] 本发明的第五个目的是提供一种提升水稻苗期高温耐受性的制剂，该制剂包括上述基因OsHTG8编码的蛋白或上述含有基因OsHTG8的表达载体。[0011] 本发明的第六个目的是提供上述基因OsHTG8或其编码的蛋白或含有基因OsHTG8的表达载体在水稻高温耐受性改良中的应用。[0012] 本发明的第七个目的是提供上述基因OsHTG8或其编码的蛋白或含有基因OsHTG8的表达载体在培育具有高温耐受性的水稻品种或种质资源改良中的应用。[0013] 本发明的第八个目的是提供一组用于分析上述基因OsHTG8表达的引物，该引物序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。[0014] 本发明具有以下有益效果：[0015] 本发明在水稻研究中发现了一个与高温耐受性相关的基因OsHTG8(Hightemperaturetolerancegene8)，证实该基因参与水稻苗期高温胁迫响应，正调控苗期高温耐受性，为改良水稻苗期高温耐受性和研究水稻高温耐受性分子机制提供了新的基因资源。附图说明[0016] 图1为OsHTG8基因受高温诱导表达上调结果。其中，(A)利用转录组测序分析不同材料苗期高温处理前后OsHTG8表达情况(3次生物学重复)；利用t检验计算P值，*和**分别表示0.05和0.01水平下差异显著。(B)利用定量PCR分析OsHTG8受高温诱导表达情况。[0017] 图2为OsHTG8?CRISPR/Cas9载体示意图。[0018] 图3为OsHTG8基因敲除靶位点及敲除植株突变方式示意图。其中，(A)OsHTG8基因结构示意图及敲除靶位点序列。(B)野生型和OsHTG8敲除突变体的靶位点序列比对。(C)野生型和OsHTG8敲除突变体的氨基酸序列比对。[0019] 图4为野生型和OsHTG8敲除材料苗期高温处理结果。其中，(A)处理前野生型日本晴与OsHTG8敲除材料表型。(B)45℃高温处理72h，恢复生长7d后野生型与OsHTG8敲除材料表型。(C)高温处理后野生型与OsHTG8敲除材料的存活率比较。(D)高温处理前后生长条件。具体实施方式[0020] 以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。[0021] 实施例1：鉴定到苗期高温诱导表达上调的基因OsHTG8[0022] 为鉴定参与水稻高温响应相关基因，从本实验室完成的33份精细基因组测序材料中(Qinetal.,2021,Cell)，选择其中几份代表性资源进行苗期高温处理(14天幼苗，45℃处理9h后取样)，并进行转录组测序。分析发现OsHTG8在多个材料中受到高温诱导后表达显著上调(图1A)，说明OsHTG8可能参与高温胁迫响应。[0023] OsHTG8基因编码区序列如下所示：[0024] ATGCCGCTGTGGGGGACAGGCTCGTCCGCGGCGTCCGCGGCGGCGGAGGGCAGCGCGGCCGGAGGGGATGGGGCGGCCCGCTCGTCGTCCGGCGGCGCCGCGGTGATCCGGTCGCTGCTCCCCACCCGCCGCCGCCTCCGCCTCGACCCGCCATCCAAGCTCTTCTTCCCTTATGAGCCTGGGAAGCAAGTCCGGAGTGCTGTCAAGATCAAGAACATCAGCAAGTCTCATGTAGCATTTAAGTTCCAAACAACAGCACCGAAGAGTTGCTTCATGAGGCCTCCAGGTGGTATACTTGCTCCAGGAGAGAGCATCATAGCTACAGTGTTCAAGTTTGTGGAGCATCCTGAGAATAATGAGAAGCCATTAGATCAGAAGTGCAAGGTTAAGTTCAAGATTGTCAGTCTGAAGGTCAAAGGACCTATGGAGTATGTCCCAGAACTGTTTGATGAGCAGAAAAACCAGGTAGCAGTTGAGCAAATTCTGCGTGTTGTATTCTTGGACGCTGAGCGTCAAACCCCACAAATGGACAAGCTCAAGCGCCAGCTTGCTGAAGCAGAGGCAGCACTTGAAGCACGCAAGAAACCTCCAGAGGACACCGGCCCCCGCATTGTTGGTGAAGGCCTTGTAATTGATGAATGGAAGGAGCGAAGAGAGAGATACCTTGCTCGTCAGCAGATTGAAGGGGTTGATTCAGCGTAG(SEQIDNO.1)。[0025] OsHTG8基因编码的蛋白，其氨基酸序列如下所示：[0026] MPLWGTGSSAASAAAEGSAAGGDGAARSSSGGAAVIRSLLPTRRRLRLDPPSKLFFPYEPGKQVRSAVKIKNISKSHVAFKFQTTAPKSCFMRPPGGILAPGESIIATVFKFVEHPENNEKPLDQKCKVKFKIVSLKVKGPMEYVPELFDEQKNQVAVEQILRVVFLDAERQTPQMDKLKRQLAEAEAALEARKKPPEDTGPRIVGEGLVIDEWKERRERYLARQQIEGVDSA(SEQIDNO.2)。[0027] 为了进一步确认OsHTG8是否受高温诱导表达，进一步利用定量PCR分析OsHTG8受高温诱导表达情况。首先，利用网站(https://qprimerdb.biodb.org/)设计OsHTG8基因的定量PCR引物Y1970?F(5’?CCAAGCTCTTCTTCCCTTATGA?3’，SEQIDNO.3)和Y1971?R(5’?GTAGCTATGATGCTCTCTCCTG?3’，SEQIDNO.4)。将野生型日本晴在光照培养箱生长14天后，转移至45℃的光照培养箱中高温处理0h、3h、6h、9h和12h后取地上部分叶片，用于后续实验。利用FOREGENE公司的植物RNA提取试剂盒提取总RNA，利用成都福际生物技术有限公司的反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，随后利用诺唯赞公司的试剂盒进行定量PCR分析，用UBQ5和FhaB作为双内参，序列如下：[0028] UBQ5?F：5’?ACCTTCATGGCCAACCACTT?3’(SEQIDNO.5)；[0029] UBQ5?R：5’?CTAAGCCTGCTGGTTGTAGA?3’(SEQIDNO.6)；[0030] FhaB?F：5’?GAGAAGCAGAAGCAGAAGGA?3’(SEQIDNO.7)；[0031] FhaB?R：5’?CTTGAATAGGACCATCAGGC?3’(SEQIDNO.8)。[0032] 结果如图1B所示，高温诱导3h后，OsHTG8表达开始显著上调，诱导9h后表达水平达到最高，证实OsHTG8参与苗期高温胁迫的响应，受高温诱导表达上调。[0033] 实施例2：OsHTG8的基因编辑载体的构建和遗传转化[0034] (1)OsHTG8基因编辑靶位点的设计[0035] 为构建OsHTG8的CRISPR/Cas9基因编辑载体，首先利用网站http://skl.scau.edu.cn/？tdsourcetag＝s_pcqq_aiomsg的targetDesign功能，在OsHTG8基因的第一外显子上选择编辑靶位点，靶位点序列为：5’?GTGGGGGACAGGCTCGTCCGCGG?3’(SEQIDNO.9)。[0036] (2)CRISPR/Cas9载体的构建[0037] 编辑靶位点确定后，进行CRISPR/Cas9载体构建，具体操作步骤如下：[0038] 引物退火形成二聚体：将10μM的靶点前后引物各5μL混合后用PCR仪进行99℃退火5min，随后将产物稀释10倍备用。[0039] 靶点序列连接中间载体：按照以下体系：0.5μMtargetadaptor1μL(即引物二聚体)；20nggRNAPlasmid1μL；1mMATP1μL；20UT4(现配现用)1μL；5UBsaI?HF0.25μL；10XCutsmartbuffer1μL；ddH2O4.75μL，将二聚体及Bas1(NEB公司)酶等混合，37℃5min，20℃2min循环5次，将靶点序列与中间载体pYLsgRNA?OsU6a连接，将此步产物稀释10倍备用。[0040] PCR扩增：将扩增引物Y3149?F(5’?CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG?3’，SEQIDNO.10)与Y1011?R(aaacCGGACGAGCCTGTCCCCCA，SEQIDNO.11)靶位点后引物结合使用，而Y3150?R(5’?CGGAGGAAAATTCCATCCAC?3’，SEQIDNO.12)与Y1010?F(gccgTGGGGGACAGGCTCGTCCG，SEQIDNO.13)靶点前引物结合使用，经PCR扩增将获得一大一小两个片段，随后利用overlapping将两个片段融合回收。[0041] 酶切连接(37℃)：将上述获得的产物按照以下体系混合：Cutsmartbuffer(NEB)1.5μL、ATPT4DNAligasebuffer(NEB)1.5μL、Cas9plasmid(PuBi?H)0.5μL、上一步产物1μL、BsaI0.5μL、T4连接酶(NEB)0.1μL、超纯水9.9μL。随后于37℃边酶切边连接3h，完成终载体连接，构建成功的终载体如图2所示。[0042] (3)大肠杆菌转化[0043] 转化：将大肠杆菌感受态DH5α(康体生命)从?80℃冰箱拿出于冰上融化5min。将上述连接的终载体全部加入100μLDH5α感受态中，混合均匀，在冰上静置30min。随后在42℃金属浴中热激75s，再冰上静置2min。随后转移至超净工作台上加入1mL无抗LB，于37℃摇床培养1h。[0044] 涂板：培养完成的菌液5000rpm离心5min，超净工作台中吸取30μL上清重悬菌体(其余上清全部丢弃)。随后均匀地涂布到LB培养板(卡那霉素抗性)，封口后放置在37℃烘箱过夜培养。[0045] 阳性克隆挑。航嘌瓿傻呐嘌迥贸鲈诔还ぷ魈ㄉ咸羧〉タ寺【湓37℃摇床扩大培养4mL(LB+卡那霉素抗性)，随后利用质粒提取试剂盒(庄盟生物)进行质粒提取。将提取完成的质粒利用通用引物Y3160?R(5’?GCGGTGTCATCTATGTTACTA?3’，SEQIDNO.14)送至生工生物进行测序确认，将测序完全正确的阳性克隆菌液及质粒留存备用。[0046] (4)农杆菌转化[0047] 从?80℃冰箱拿出农杆菌感受态EHA105(擎科生物)于冰上融化，加入2μl阳性克隆质粒，混匀后于冰上静置5min，随后于液氮中瞬时冰冻5min，再放置在37℃水浴锅中5min，接下来冰上放置5min，随后向该产物中加入1mL无抗LB，于28℃摇床上培养2?3h，离心后进行涂板(卡那霉素+利福平双抗)。涂板步骤同上。[0048] (5)水稻遗传转化[0049] 愈伤诱导：取粳稻日本晴(Nip)种子约500颗，去颖壳备用。随后进行愈伤的诱导，具体操作步骤为：先用70％的酒精、50％的次氯酸钠分别消毒1min和30min，再用灭菌的超纯水反复清洗15次，完成清洗步骤后用灭菌的滤纸完全吸干种子表面的水分，随后将状态良好的种子摆放在NMB培养基上培养。[0050] 农杆菌侵染：首先将上述转化完成的农杆菌阳性克隆28℃摇床中扩大培养50mL，常温离心后收集菌体。利用加有乙酰丁香酮的AAM液体培养基将菌体重悬备用。挑选长势良好的愈伤组织，将其与AAM培养基在无菌环境中浸润30min，用灭菌滤纸吸干愈伤组织的培养基，再将愈伤组织放回培养室培养至少2d。[0051] 筛。号嘌2d后的愈伤组织分别用无菌水和加有头孢霉素的无菌水清洗，清洗完成后将培养基再次放回培养室培养三周以上，然后将其转移至分化培养基上生根，继续培养直至植株能够用于炼苗，移栽。[0052] 实施例3：OsHTG8敲除突变体苗期高温处理表型分析[0053] (1)敲除转基因苗检测[0054] 获得转基因苗后，首先利用潮霉素检测引物Y214?F(5’?TACACAGCCATCGGTCCAGA?3’，SEQIDNO.15)及Y215?R(5’?TAGGAGGGCGTGGATATGTC?3’，SEQIDNO.16)对转基因植株进行扩增，检测载体转化情况。随后挑选载体转化成功的株系利用跨靶位点扩增引物Y1024?F(5’?CACTCACTCCACCACCACAA?3’，SEQIDNO.17)和Y1025?R(5’?ATCCTTGGACAGAGCAACCG?3’，SEQIDNO.18)进行扩增测序。共获得2种不同突变方式的纯合株系(即OsHTG8敲除突变体)，分别命名为OsHTG8?KO1和OsHTG8?KO2。其中OsHTG8?KO1在靶位点插入1个碱基，导致蛋白翻译提前终止；OsHTG8?KO2在靶位点出现碱基替换和缺失，导致4个氨基酸替换以及7个氨基酸缺失(图3)。[0055] (2)苗期高温处理[0056] 鉴于OsHTG8在苗期高温处理后表达显著上调，其可能参与高温胁迫响应。为了验证OsHTG8对高温的耐受性，对野生型和OsHTG8敲除突变体28℃培养10d的幼苗，进行苗期高温处理(45℃，72h)，之后28℃恢复生长7d，统计存活率。高温处理后OsHTG8敲除突变体完全死亡，而野生型存活率达到73％(图4)。表明OsHTG8参与苗期高温胁迫的响应，并正调控水稻的苗期高温耐受性。[0057] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

专利地区：四川

专利申请日期：2023-10-19

专利公开日期：2024-10-11

专利公告号：CN117646008B