开云优惠体育网页版入口

专利名称：甜瓜分枝性状主效QTLfb3.2紧密连锁的分子标记Site1119及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202311548197.8

专利申请（专利权）人：黑龙江八一农垦大学
权利人地址：黑龙江省大庆市高新区新风路5号

专利发明（设计）人：发明人:盛云燕,戴冬洋,翟莹,杨丽敏,付丽婷,陈可欣,王岭,鞠航

专利摘要：甜瓜分枝性状主效QTLfb3.2紧密连锁的分子标记Site1119及其应用，属于植物分子遗传育种研究领域。将该分子标记在若干个甜瓜自然群体中进行分枝性状检测，用待选材料DNA为模板，分子标记Site1119的引物对其进行PCR扩增，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并结合田间性状分析，分子标记苗期鉴定准确率为100％。本发明分子标记在甜瓜生产实践、育种中具有非常重要的价值。操作方法简便，稳定性高，快速且准确，为甜瓜分子育种提供了辅助选择的新方法。

主权利要求：
1.甜瓜分枝性状分子标记Site1119用于甜瓜苗期筛选具有潜在少分枝性状种质资源的应用，其特征在于：所述分子标记Site1119的引物序列为：Site1119F：TCCGGACAATATGTGGACAA，Site1119R：ATTGGGTTTCAAGGATGTCG；
所述甜瓜为品种7223H、品种S8及两者杂交后代；
所述应用为：
（1）以待鉴定材料DNA为模板，分子标记Site1119的引物对其进行PCR扩增；
（2）PCR扩增后，获得的PCR产物经MfeI酶切反应后，使用电泳方式检测，246bp特异条带为少分枝品种，246bp和275bp杂合条带为中间型品种，275bp条带为正常分枝品种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（1）中，PCR扩增体系为10μL：包括Site1119F1μL、Site1119R1μL、TaqMasterMix3μL、DNA模板1μL、ddH2O4μL。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（1）中，PCR扩增程序：在95°C下预变性
5min；在95°C变性30s，在55°C退火30s，在72°C延伸45s，35个循环；72°C延伸10min，4°C保存。 说明书 : 甜瓜分枝性状主效QTLfb3.2紧密连锁的分子标记Site1119及
其应用技术领域[0001] 本发明属于植物分子遗传育种研究领域，提供一种甜瓜分枝性状主效QTLfb3.2紧密连锁的分子标记Site1119及其应用，可用于甜瓜分枝性状苗期分子标记辅助育种。背景技术[0002] 甜瓜(CucumismeloL.)为葫芦科甜瓜属一年生蔓生草本植物，是葫芦科重要的经济作物之一，栽培面积广，其具有较强的杂种优势，具有巨大的经济价值。植物株型是重要的农艺性状，由株高、分枝(分蘖)模式、叶形和穗型等组成。植物株型与植物环境适应能力、生存竞争能力及产量密切相关，对农业机械化等农业实践具有重要意义。研究表明，在蔬菜生产中，例如甘蓝型油菜、西瓜、黄瓜、番茄等作物具有较强的分枝。尤其是甜瓜，设施栽培中常常采用单蔓或双蔓的种植模式，每一节间都产生分枝，在实际生产中往往需要投入大量的劳动力和时间进行整枝修剪从而实现增产保质的目的。此外，分枝过多不仅会使主茎的长势变弱消耗营养，而且会使空间环境变得更为密集，从而增加了病虫害的发生，所以生产者更倾向于选择少分枝或无分枝的类型。但目前甜瓜多数品种分枝较多，且在生长期中不断伸长，不仅会因过度的营养生长影响果实品质，同时分枝过多还不便于果实成熟后的采收。多分枝性状己经成为当前制约甜瓜产业化和规模化发展的一个瓶颈，因此培育少分枝甚至无分枝甜瓜新品种，探索轻简化栽培新模式，必将有力的促进甜瓜产业化和规模化发展。解析甜瓜分枝形成发育的遗传基础与调控机理是选育少分枝品种的基础和前提，对于加快甜瓜株型改良与分子育种进程具有重要的现实意义。[0003] 有关蔬菜作物的分枝性状的遗传研究已有报道，涉及分枝(蔓)性状观测、遗传规律、QTL定位等，主要集中在番茄、拟南芥、西瓜等几种瓜果类作物，通过基因编辑技术获得不同分枝类型新种质。目前在甜瓜上也有几例关于分枝性状遗传规律和QTL定位的报道，但并未涉及到候选基因分析。发明内容[0004] 基于背景技术部分的研究，本发明提供一种甜瓜分枝性状主效QTLfb3.2紧密连锁的分子标记Site1119及其应用，利用少分枝甜瓜品种S8为母本，正常分枝甜瓜品种7223H为父本，配置杂交组合获得F1，对所获得F1连续自交，得到其F2、F2:3家系，并将F2群体用于甜瓜分枝性状初步定位、F2:3家系用于候选基因精细定位。根据BSA(BulkSegregatingAnalysis)测序结果，获得的QTL位点fb3.2通过F2:3家系进一步精细定位缩小候选区间，选择效率更高的甜瓜分枝性状连锁的分子标记。[0005] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：[0006] 甜瓜分枝性状主效QTLfb3.2紧密连锁的分子标记Site1119，所述分子标记Site1119的引物序列为：[0007] Site1119F：TCCGGACAATATGTGGACAA，[0008] Site1119R：ATTGGGTTTCAAGGATGTCG。[0009] 上述的分子标记Site1119用于甜瓜苗期筛选具有潜在少分枝性状种质资源的应用。[0010] 进一步地，所述应用为：将该分子标记在若干个甜瓜自然群体中进行分枝性状检测，用待选材料DNA为模板，分子标记Site1119的引物对其进行PCR扩增，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并结合田间性状分析。[0011] 进一步地，所述应用为：[0012] (1)以待鉴定材料DNA为模板，分子标记Site1119的引物对其进行PCR扩增；PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色；[0013] (2)标记引物鉴定：待测DNA样品经过PCR扩增后，获得PCR产物需经MfeI酶切反应后，使用电泳方式能检测，246bp特异条带为少分枝品种，246bp和275bp杂合条带为中间型品种，275bp条带为正常分枝品种。[0014] 进一步地，步骤(1)中，PCR扩增体系为10μL：包括上游引物1μL、下游引物1μL、TaqMasterMix酶3μL、DNA模板1μL、ddH2O4μL。[0015] 进一步地，步骤(1)中，PCR扩增程序：在95℃下预变性5min，在95℃变性30s，在55℃退火30s，在72℃延伸45s，(95℃变性30s，在55℃退火30s，72℃延伸45s重复35个循环)，72℃延伸10min，4℃保存。[0016] 本发明相对于现有技术的有益效果为：[0017] 1、CAPS(CleavedAmplifiedPolymorphismSequences)分子标记，是一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，其基本原理是根据BSA测序结果筛选出差异SNP位点，设计含有SNP位点的特异性引物，在SNP位点包含限制性内切酶位点，通过聚丙烯凝胶电泳分离酶切片段。本发明根据BSA测序技术，比对甜瓜基因组数据，设计开发与甜瓜分枝性状连锁标记的CAPS标记，通过CAPS分子标记辅助育种的方法，在甜瓜幼苗期就可以进行含有少分枝位点植株的筛。跎倭擞值哪晗，并极大的提高了育种效率，克服了实际生产只能在植株定植后营养生长期区分甜瓜是多分枝还是少分枝，从而减少甜瓜修剪带来营养生长的浪费及人工投入。[0018] 2、通过利用本发明提供的特异性引物对采用PCR方法检测待测甜瓜的基因组DNA，扩增CAPS分子标记Site1119，甜瓜正常分枝材料基因扩增产物为275bp，甜瓜少分枝性状材料其基因扩增产物为246bp，通过此分子标记可以准确对甜瓜进行分枝性状筛。糜谔鸸现仓昝缙谏秆。蟠筇嵘颂鸸系挠中。[0019] 3、目前国内外对甜瓜甜瓜分枝性状主效QTLfb3.2紧密连锁的分子标记未见相关报道，本发明的分子标记Site1119根据与甜瓜分枝性状紧密连锁QTLfb3.2设计而成。[0020] 4、本发明分子标记在甜瓜生产实践及育种中具有重要的价值。[0021] 5、本发明操作方法简单，稳定性强，为甜瓜分子育种提供了新方法。附图说明[0022] 图1为甜瓜分枝性状的精细定位图；[0023] 图2为甜瓜Site1119标记在30个自然群体中检测电泳图。具体实施方式[0024] 下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。[0025] 本发明通过甜瓜分枝性状遗传机制和分枝性状QTL定位研究。利用少分枝甜瓜品种S8为母本，正常分枝甜瓜品种7223H为父本，配制杂交组合，构建F2分离群体和F2:3家系，利用F2分离群体对进行初步定位，利用F2:3家系进行进一步精细定位，开发更为精细，距离选择甜瓜分枝性状距离更近，选择效率更高的甜瓜分枝性状的连锁分子标记。[0026] 具体实施方式一：本实施方式记载的是一种与甜瓜分枝性状紧密连锁的分子标记Site1119，其引物序列为：[0027] Site1119F：TCCGGACAATATGTGGACAA，[0028] Site1119R：ATTGGGTTTCAAGGATGTCG。[0029] 上述分子标记Site1119的获得方法如下：[0030] 1、甜瓜遗传群体的构建[0031] 利用正常分枝甜瓜品种7223H为父本，少分枝甜瓜品种S8为母本，配置杂交组合“S8×7223H”得到F1群体，将F1自交得到F2分离群体，将得的F2分离群体自交获得F2:3家系。父本和母本杂交可以获得无数F1单株，这些单株的基因型和表现型是一致的，随机选择F1单株均可，自交获得F2，F2随机选择自交获得F2:3家系；[0032] 2020年在黑龙江八一农垦大学航天育种基地各种植S8(20株)、7223H(20株)、F1单株(20株)，以及F2分离群体(200株)；2021年在海南育种基地种植F2:3家系(共130个家系，每个家系10株)，以上甜瓜材料均在温室大棚内种植，栽培方式为常规的水肥管理，单株授粉，不整枝。待植株完成营养生长后进行田间分枝性状调查。[0033] 2、基因组DNA的提取和基因池构建[0034] 采用CTAB法提取130个F2:3家系的基因组DNA。[0035] 3、CAPS分子标记筛选[0036] 通过对正常分枝甜瓜品种7223H及少分枝甜瓜品种S8进行高通量测序，得到两个亲本的基因组序列信息，分析比较两个亲本间差异性位点，利用BSA方法获得与甜瓜分枝性状连锁QTLfb3.2位点紧密连锁的分子标记，共设计开发分子标记30对，在正常分枝甜瓜基因池和少分枝甜瓜基因池之间进行PCR扩增和多态性筛。采秆〉16对引物。如图1所示，根据甜瓜分枝性状连锁QTLfb3.2位点连锁的分子标记，其中发现Site1119与甜瓜分枝性状紧密连锁。[0037] 具体实施方式二：本实施方式提供了甜瓜分枝性状连锁的分子标记Site1119的方法，具体步骤如下：[0038] (1)提取待测样品的DNA，采用分子标记Site1119进行PCR扩增。10μLPCR反应体系为：50?100ng/μLDNA1μL，Site1119引物上下游各1μL，Taq酶Mix3μL，ddH2O4μL。PCR扩增条件为：在95℃下预变性5min，在95℃变性30s，在55℃退火30s，在72℃延伸45s，第2步到第4步35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。[0039] (2)待测DNA样品经过PCR扩增后，PCR反应产物用于MfeI酶切反应，酶切方法为：PCR反应产物10μL、MfeI限制性内切酶0.5μL，浓度为1U/μL、10×FastDigestbuffer2μL，去离子水7.5μL，酶切反应在37℃水浴锅中温浴20min，加入4μL6×loadingbuffer。电泳方式能检测出246bp片段的为少分枝甜瓜材料，而片段大小为275bp的则是正常分枝甜瓜材料，如图2所示，1代表母本，少分枝甜瓜；2代表父本，正常分枝甜瓜；3条带为F1属中间型；4?9为条带与S8相同的品种，少分枝类；10?16条带与7223H相同的品种，正常分枝类；17?22为条带中间型品种，甜瓜分枝性状鉴定准确率为100％。因此，通过紧密连锁标记的扩增能准确区分甜瓜分枝性状位点的不同基因型，达到辅助育种的目的。

专利地区：黑龙江

专利申请日期：2023-11-20

专利公开日期：2024-10-11

专利公告号：CN117568512B