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专利名称：垫状卷柏活性提取物及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410827253.X

专利申请（专利权）人：湖南开云优惠体育网页版入口学院
权利人地址：湖南省永州市零陵区杨梓塘路130号

专利发明（设计）人：发明人:陈小明,罗丽媛,杨绍昌,谢夷,肖湘露,邵金华

专利摘要：本发明公开了垫状卷柏活性提取物及其应用。本发明利用硅胶、MCI柱色谱等分离手段对垫状卷柏全草的化学成分进行研究，从中分离鉴定了6个化合物，包括2个环肽、1个酰胺类生物碱和3个selaginellin类化合物。其中，化合物1是一个新的环八肽，化合物5和6为首次从垫状卷柏中分离得到。药理活性评价结果显示，化合物1?5对人肝癌细胞(HepG2)和人肺癌细胞(A549)均表现出不同程度的增殖抑制作用。本发明对垫状卷柏化学成分及其抗肿瘤活性进行探索，研究结果可为该植物资源进一步的开发利用提供参考和科学依据。

主权利要求：
1.垫状卷柏活性提取物，其特征在于，包括化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6；其化学结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述垫状卷柏活性提取物，其特征在于，所述化合物1含有8个氨基酸残基，包括1个酪氨酸、1个甘氨酸、1个丙氨酸、2个苏氨酸、1个亮氨酸、1个苯丙氨酸和1个脯氨酸。
3.根据权利要求1所述垫状卷柏活性提取物，其特征在于，所述化合物2为selaginellinG。
4.根据权利要求1所述垫状卷柏活性提取物，其特征在于，所述化合物3为selaginellinP。
5.根据权利要求1所述垫状卷柏活性提取物，其特征在于，所述化合物4为selagibenzophenoneA。
6.根据权利要求1所述垫状卷柏活性提取物，其特征在于，所述化合物5为N?(2E)?3?(3,4?dihydrophenyl)prop?N1′?(4?aminobutyl)?3?pyrrole?formaldehyde。
7.根据权利要求1所述垫状卷柏活性提取物，其特征在于，所述化合物6为环?(L?羟脯氨酸?L?亮氨酸)二肽。
8.权利要求1所述垫状卷柏活性提取物在制备抗肿瘤的药物中的应用。
9.权利要求1所述垫状卷柏活性提取物在制备增殖抑制癌细胞的试剂中的应用。
10.根据权利要求9所述垫状卷柏活性提取物在制备增殖抑制癌细胞的试剂中的应用，其特征在于，所述癌细胞为人肝癌细胞HepG2和人肺癌细胞A549。 说明书 : 垫状卷柏活性提取物及其应用技术领域[0001] 本发明属于药用植物活性提取物开发技术领域，具体涉及一种垫状卷柏活性提取物及其应用。背景技术[0002] 垫状卷柏(Selaginellapulvinata)俗名“九死还魂草”，系卷柏科卷柏属植物，常生于海拔100?4250m裸露的石灰岩表面或石缝中，在中国、蒙古、俄罗斯西伯利亚、朝鲜半岛、日本、印度北部、越南和泰国等地均有广泛分布。据《神农本草经》记载，垫状卷柏具有较高的药用价值，作为传统中药其使用历史最早可追溯至公元1062年左右。作为官方用药的垫状卷柏是药材卷柏的基源植物之一，被收载于2020版《中国药典》，其以全草入药，性平、味辛，归肝、心经，具有通经散血、消炎退热的功效，可用于治疗闭经痛经、跌打损伤等症；经炒制成的卷柏炭具有良好的止血化瘀功效，可用于治疗吐血、崩漏以及便血等症。[0003] 现代研究表明，垫状卷柏成分类型丰富，主要含有黄酮、炔酚、生物碱和木脂素，此外还含有少量甾体、苯丙素、有机酸及其它类化合物。纵观目前国内外研究现状，虽然垫状卷柏化学成分和药理活性已有部分文献报道，但还不够系统全面，仍存在较大的研究空间，相关研究有待深入。鉴于此，本申请对垫状卷柏95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位进行化学成分研究，并对所分离得到的化合物进行抗肿瘤活性筛。云谖孀淳戆氐慕徊娇⒑屠锰峁┎慰己涂蒲б谰。发明内容[0004] 本发明的目的在于提供一种垫状卷柏活性提取物及其应用。[0005] 一种垫状卷柏活性提取物，包括化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6；其化学结构式如下所示：[0006][0007] 所述化合物1含有8个氨基酸残基，包括1个酪氨酸、1个甘氨酸、1个丙氨酸、2个苏氨酸、1个亮氨酸、1个苯丙氨酸和1个脯氨酸。[0008] 所述化合物2为selaginellinG。[0009] 所述化合物3为selaginellinP。[0010] 所述化合物4为selagibenzophenoneA。[0011] 所述化合物5为N?(2E)?3?(3,4?dihydrophenyl)prop?N1′[0012] ?(4?aminobutyl)?3?pyrrole?formaldehyde。[0013] 所述化合物6为环?(L?羟脯氨酸?L?亮氨酸)二肽。[0014] 所述垫状卷柏活性提取物在制备抗肿瘤的药物中的应用。[0015] 所述垫状卷柏活性提取物在制备增殖抑制癌细胞的试剂中的应用。[0016] 优选的，所述癌细胞为人肝癌细胞HepG2和人肺癌细胞A549。[0017] 本发明的有益效果：本发明利用硅胶、MCI柱色谱等分离手段对垫状卷柏全草的化学成分进行研究，从中分离鉴定了6个化合物，包括2个环肽、1个酰胺类生物碱和3个selaginellin类化合物。其中，化合物1是一个新的环八肽，化合物5和6为首次从垫状卷柏中分离得到。药理活性评价结果显示，化合物1?5对人肝癌细胞(HepG2)和人肺癌细胞(A549)均表现出不同程度的增殖抑制作用。本发明对垫状卷柏化学成分及其抗肿瘤活性进行探索，研究结果可为该植物资源进一步的开发利用提供参考和科学依据。附图说明[0018] 图1为化合物1关键的2DNMR相关和MS2片段分析。具体实施方式[0019] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。[0020] 实施例1[0021] 1材料[0022] Bruker400MHz和Bruker600MHz核磁共振仪(德国Bruker公司)；Agilent6500Q?TOF液质联用仪(美国安捷伦公司)；NicoletiS5FTIR傅里叶红外光谱仪(美国赛默飞世尔开云优惠体育网页版入口公司)；Autopol?Ⅲ旋光仪(德国Rudolph公司)；P3000型高效液相色谱仪(北京创新通恒开云优惠体育网页版入口有限公司)；制备型C18色谱柱：5μm，250mm×20mm(日本YMC公司)；XS105电子天平(瑞士MettlerToledo公司)；CHP20P小孔树脂(日本Nacalaitesque)；柱色谱硅胶和硅胶GF254薄层板(青岛海洋化工厂)；SephadexLH?20(瑞典GEHealthcare)；色谱纯甲醇、乙腈(美国Tedia公司)；二氯甲烷等分析纯试剂(西陇化工股份有限公司)；人肺癌细胞株A549和人肝癌细胞株HepG2(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；胎牛血清和DMEM培养基(美国FisherScientific)；青霉素/链霉素和噻唑蓝四溴化铵(MTT)购自碧云天生物技术公司(上海，中国)；阿霉素(adriamycin，美国MedChemExpress)。[0023] 垫状卷柏全草于2022年6月采自云南省贡山独龙族怒族自治县，经湖南开云优惠体育网页版入口学院姜红宇副教授鉴定为卷柏科卷柏属植物垫状卷柏(Selaginellapulvinata)，凭证标本(PS202206X1)存放于湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室。[0024] 2提取与分离[0025] 垫状卷柏干燥全草4.2kg，粉碎过筛后用95％乙醇回流提取3次(液料比12∶1)，每次2h，浓缩提取液得总浸膏815g。往浸膏中加入适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃。ㄋ踺腿∫旱玫绞兔巡课76g、乙酸乙酯部位152g、正丁醇萃取物214g和水部位373g。乙酸乙酯部位经硅胶柱色谱分离，二氯甲烷?甲醇(100∶1～1∶100)梯度洗脱得到9个组分(Fr.A～Fr.I)。组分Fr.D(8.4g)经小孔树脂柱色谱以甲醇?水(30∶70～100∶1)梯度洗脱得到7个组分(Fr.D.1～Fr.D.7)。组分Fr.D.3(816.8mg)经SephadexLH?20凝胶柱(甲醇)和半制备HPLC(甲醇?水，40∶60，6.0mL/min)纯化得到化合物1(9.4mg，tR＝18.7min)。组分Fr.D.5(1.8g)经硅胶柱色谱，二氯甲烷?甲醇(80∶1～10∶1)梯度洗脱得到6个组分(Fr.D.5.1～Fr.D.5.6)。组分Fr.D.5.2(116.9mg)经半制备HPLC(乙腈?水，30∶70，6.0mL/min)纯化得到化合物2(17.6mg，tR＝21.5min)、3(14.7mg，tR＝31.2min)和4(10.5mg，tR＝23.4min)。组分Fr.D.5.4(211.7mg)经SephadexLH?20凝胶柱(甲醇)纯化和薄层制备得到化合物5(34.5mg)和6(15.8mg)。[0026] 3结构鉴定[0027] 化合物1白色无定型状粉末， (c0.1，MeOH)；HR?ESI?MSm/z851.4281[M++H] (计算值851.4298)，推测其分子式为C42H58N8O11，不饱和度为18；IR(KBr)νmax3405、3?1292、2966、2933、1644、1510、1384、1237、1204、1146、996cm ，提示结构中存在羟基、酰胺羰基和胺基等官能团；其茚三酮反应呈阴性，而经HCl水解后即呈现茚三酮显色反应，据此推测该化合物可能为环肽。[0028] 1HNMR谱中7个仲胺(δH8.69，8.62，8.62，8.52，7.87，7.78，7.35)和13CNMR谱中8个酰胺羰基(δC172.7，171.3，171.0，170.8，170.1，169.5，169.4，168.8)特征位移信号，提示化合物1可能是环八肽。通过酸水解和MS分析确定化合物1含有8个氨基酸残基，包括1个酪氨酸(Tyr)、1个甘氨酸(Gly)、1个丙氨酸(Ala)、2个苏氨酸(Thr)、1个亮氨酸(Leu)、1个苯丙氨酸(Phe)和1个脯氨酸(Pro)。结合2DNMR谱图中的相关信号，8个氨基酸片段的核磁数据得到了明确的归属(表1)。[0029] 在HMBC谱中，δH7.78(Tyr?NH)/δC168.8(Gly,C＝O)，δH3.14,3.93(Gly,H?11)/1 1δC172.7(Ala,C＝O)，δH8.69(Ala?NH)/δC170.8(Thr ,C＝O)，δH8.52(Thr ?NH)/δC2 2171.3(Leu,C＝O)，δH7.87(Leu?NH)/δC169.4(Thr ,C＝O)，δH7.35(Thr?NH)/δC169.5(Phe,C＝O)，δH8.62(Phe?NH)/δC171.0(Pro,C＝O)存在相关。在NOESY谱中，δH7.78(Tyr?NH)/3.14,3.93(Gly,H?11)，δH8.62(Gly?NH)/3.87(Ala,H?13)，δH8.69(Ala?NH)/4.211 1 2(Thr ,H?16)，δH8.52(Thr?NH)/4.27(Leu,H?20)，δH7.87(Leu?NH)/4.79(Thr ,H?26)，δH27.35(Thr?NH)/3.84(Phe,H?30)，δH8.62(Phe?NH)/3.87(Pro,H?39)，δH3.66,3.79(Pro,H?42)/4.83(Phe,H?2)存在相关(图1a)。上述相关信号提示氨基酸的连接顺序为cyclo[?1 2Tyr?Gly?Ala?Thr?Leu?Thr?Phe?Pro?]，HR?ESI?MS/MS分析进一步验证了该连接顺序(图1b)。通过Marfey试剂衍生化的方法确定了化合物1水解后的氨基酸残基的衍生物与各L型的氨基酸对照品的衍生物在HPLC中出峰时间一致，确定除Gly没有手性以外，化合物1中的2氨基酸残基均为L型。综上所述，化合物1的结构为cyclo[L?Tyr?Gly?L?Ala?L?Thr?L?Leu?1L?Thr?L?Phe?L?Pro]，为未见文献报道的新化合物，命名为pulvpeptinB。[0030] 表1化合物1的核磁共振波谱数据(DMSO?d6,600/150MHz)[0031][0032][0033] 注：*信号峰归属可能会互换。[0034] 化合物2淡黄色粉末；HR?ESI?MSm/z523.1519[M+Na]+，分子式为C33H24O5。1H?NMR(CD3OD,400MHz)δH:7.40(1H,t,J＝7.6Hz,H?16),7.35(2H,d,J＝8.4Hz,H?28/32),7.21(1H,d,J＝7.6Hz,H?15),7.21(1H,d,J＝7.6Hz,H?17),7.04(1H,s,H?26),6.99(2H,d,J＝8.4Hz,H?3/5),6.99(2H,d,J＝8.4Hz,H?8/12),6.98(2H,d,J＝8.4Hz,H?20/24),6.68(2H,d,J＝8.4Hz,H?29/31),6.56(2H,d,J＝8.4Hz,H?21/23),6.43(2H,d,J＝8.4Hz,H?2/6),6.43(2H,13d,J＝8.4Hz,H?9/11)；C?NMR(CD3OD,100MHz)δC:192.2(C?27),163.4(C?30),159.8(C?22),157.2(C?1),157.2(C?10),155.7(C?7),142.5(C?14),142.5(C?18),139.3(C?19),134.5(C?4),134.5(C?13),133.9(C?25),131.8(C?33),131.6(C?28/32),131.3(C?3/5),131.3(C?8/12),130.4(C?20/24),129.9(C?15),129.9(C?17),128.2(C?16),123.6(C?26),116.0(C?29/31),115.9(C?21/23),115.3(C?2/6),115.3(C?9/11)。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物2为selaginellinG。[0035] 化合物3红色粉末；HR?ESI?MSm/z511.1918[M+H]+，分子式为C35H26O4。1H?NMR(DMSO?d6,600MHz)δH:7.64(1H,d,J＝7.8Hz,H?15),7.54(1H,t,J＝7.8Hz,H?16),7.46(1H,dd,J＝9.6,1.8Hz,H?3),7.35(1H,d,J＝7.8Hz,H?17),7.26(1H,dd,J＝9.6,1.8Hz,H?5),6.96(2H,d,J＝8.4Hz,H?28/32),6.80(2H,m,H?8/12),6.80(2H,m,H?9/11),6.79(2H,d,J＝8.4Hz,H?20/24),6.67(2H,d,J＝8.4Hz,H?29/31),6.58(2H,d,J＝8.4Hz,H?21/23),6.40(1H,dd,J＝9.6,1.8Hz,H?2),6.35(1H,dd,J＝9.6,1.8Hz,H?6),3.99(2H,q,J＝6.6Hz,H?1334),1.26(3H,t,J＝6.6Hz,H?35)；C?NMR(DMSO?d6,150MHz)δC:185.8(C?1),159.9(C?10),158.6(C?30),158.3(C?7),156.8(C?22),142.5(C?18),140.4(C?19),139.8(C?5),138.5(C?3),133.0(C?28/32),132.8(C?8/12),130.6(C?4),130.5(C?13),130.5(C?25),130.2(C?15),130.1(C?17),129.7(C?16),129.7(C?20/24),128.3(C?2),128.1(C?6),124.2(C?14),115.8(C?29/31),114.7(C?21/23),114.0(C?9/11),111.8(C?33),93.8(C?27),86.6(C?26),63.2(C?34),14.4(C?35)。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物3为selaginellinP。[0036] 化合物4红色粉末；HR?ESI?MSm/z475.1522[M+H]+，分子式为C31H22O5。1H?NMR(CD3OD,400MHz)δH:7.57(2H,d,J＝8.4Hz,H?26/30),7.50(2H,sH?9/11),7.39(2H,d,J＝8.4Hz,H?3/5),7.12(4H,d,J＝8.4Hz,H?14/18/20/24),6.90(2H,d,J＝8.4Hz,H?27/29),136.64(4H,d,J＝8.4Hz,H?15/17/21/23),6.56(2H,d,J＝8.4Hz,H?2/6)；C?NMR(CD3OD,100MHz)δC:200.5(C?7),165.9(C?1),158.7(C?28),157.8(C?16/22),142.9(C?10),142.4(C?8/12),137.8(C?13),133.6(C?3/5),133.3(C?19/25),132.8(C?31),131.4(C?14/18/20/24),130.6(C?4),129.3(C?26/30),127.6(C?9/11),116.8(C?27/29),116.6(C?2/6),115.8(C?15/17/21/23)。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物4为selagibenzophenoneA。[0037] 化合物5白色粉末；HR?ESI?MSm/z329.1492[M+H]+，分子式为C18H20N2O4。1H?NMR(DMSO?d6,600MHz)δH:9.50(1H,s,H?6″),7.97(1H,t,J＝5.4Hz,H?1′),7.31(1H,brs,H?2″),7.21(1H,d,J＝15.6Hz,H?3),7.02(1H,dd,J＝4.2,1.8Hz,H?5″),6.93(1H,d,J＝1.8Hz,H?5),6.82(1H,d,J＝8.4,1.8Hz,H?9),6.73(1H,d,J＝8.4Hz,H?8),6.30(1H,d,J＝15.6Hz,H?2),6.23(1H,dd,J＝4.2,1.8Hz,H?4″),4.29(2H,t,J＝7.2Hz,H?5′),3.14～3.12(2H,overlapped,H?2′),1.38～1.35(2H,overlapped,H?3′),1.69～1.66(2H,overlapped,13H?4′)；C?NMR(DMSO?d6,150MHz)δC:179.7(C?6″),165.8(C?1),147.8(C?7),146.0(C?6),139.4(C?3),132.6(C?2″),131.4(C?3″),126.9(C?4),124.9(C?5″),120.8(C?9),119.0(C?2),116.2(C?8),114.3(C?5),109.8(C?4″),48.1(C?5′),38.6(C?2′),29.1(C?4′),26.8(C?[23]3′)。以上数据与文献 报道基本一致，故鉴定化合物5为N?(2E)?3?(3,4?dihydrophenyl)prop?N1′?(4?aminobutyl)?3?pyrrole?formaldehyde。[0038] 化合物6淡黄色粉末；HR?ESI?MSm/z227.1392[M+H]+，分子式为C11H18N2O3。1H?NMR(600MHz,CD3OD)δH:4.53(1H,dd,J＝10.2,6.6Hz,H?8),4.45(1H,t,J＝4.2Hz,H?6),4.18(1H,m,H?3),3.68(1H,dd,J＝13.2,4.8Hz,H?9b),3.42(1H,d,J＝12.6Hz,H?9a),2.28(1H,dd,J＝13.2,6.0Hz,H?7b),2.10(1H,m,H?7a),1.91(2H,overlapped,H?10b,H?11),1.5113(1H,m,H?10a),0.96(6H,dd,J＝6.0,3.0Hz,H?12,H?13)；C?NMR(150MHz,CD3OD)δC:173.2(C?5),169.4(C?2),69.5(C?8),59.1(C?6),55.4(C?9),55.0(C?3),39.8(C?10),38.6(C?7),26.2(C?11),23.7(C?13),22.4(C?12)。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物6为环?(L?羟脯氨酸?L?亮氨酸)二肽。[0039] 4抗肿瘤活性筛选[0040] 表2化合物1～6的细胞毒作用( n＝3)[0041][0042] 以阿霉素为阳性对照，参照文献方法采用MTT法测定化合物1～6的抗肿瘤活性。测试结果见表2，除化合物6外，其余5个化合物对人肝癌细胞(HepG2)和人肺癌细胞(A549)均表现出不同程度的增殖抑制作用，其中化合物1显示出较强的抗肿瘤活性，对上述2种肿瘤细胞株的IC50值分别为10.24±0.33，9.32±0.81μM。化合物5对2种肿瘤细胞株显示出中等程度的抗肿瘤活性，IC50值分别为15.86±1.22，13.06±0.49μM。[0043] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

专利地区：湖南

专利申请日期：2024-06-25

专利公开日期：2024-10-08

专利公告号：CN118743745A