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专利名称：猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液及其制备方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410716310.7

专利申请（专利权）人：四川农业大学,华派生物技术(集团)股份有限公司
权利人地址：四川省雅安市雨城区新康路46号

专利发明（设计）人：发明人:邱文英,贾仁勇,徐静,张丽燕,黄娟

专利摘要：本发明公开了一种猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液及其制备方法，属于生物制品技术领域。该猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液包括A组分和B组分；A组分包括以下原料：氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、海藻酸钠、壳聚糖、乳糖及水；B组分包括以下原料：黄连提取物、黄芪提取物、黄柏提取物、栀子提取物及水。本发明还公开了猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液的制备方法。本发明制备的猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液解决了流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗经胃消化后疫苗失活或降解，无法实现免疫保护的问题。

主权利要求：
1.猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液，其特征在于，包括A组分和B组分；所述A组分与B组分的质量比为1.5～2.5:1；
所述A组分包括以下质量份原料：氯化钠7.5～8.5份、氯化钾0.1～0.3份、磷酸二氢钠
1.3～1.5份、磷酸二氢钾0.2～0.3份、海藻酸钠1～3份、壳聚糖1～3份、乳糖0.5～2份及水
900～1100份；
所述B组分包括以下质量份原料：黄连提取物30～90份、黄芪提取物20～60份、黄柏提取物20～60份、栀子提取物30～90份及水900～1100份。
2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液，其特征在于，所述A组分与B组分的质量比为2:1。
3.如权利要求1所述的猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液，其特征在于，所述A组分包括以下质量份原料：氯化钠8份、氯化钾0.2份、磷酸二氢钠1.41份、磷酸二氢钾0.24份、海藻酸钠2份、壳聚糖2份、乳糖1份及水1000份。
4.如权利要求1所述的猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液，其特征在于，所述B组分包括以下质量份原料：黄连提取物90份、黄芪提取物60份、黄柏提取物60份、栀子提取物90份及水1000份。
5.权利要求1～4任一项所述的猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将A组分中的原料混合并调节pH为6.0～7.0，再灭菌，得A组分；
(2)将B组分中的原料混合并灭菌，得B组分；
(3)将A组分与B组分按质量比混合，即得。
6.如权利要求5所述的猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中调节pH为6.0。
7.如权利要求5所述的猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)及步骤(2)中灭菌温度均为110～120℃，灭菌时间均为15～
20min。
8.如权利要求7所述的猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)及步骤(2)中灭菌温度均为116℃，灭菌时间均为15min。
9.一种猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗，其特征在于，包括猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗原液和权利要求1～4任一项所述的稀释液。
10.如权利要求9所述的猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗，其特征在于，所述流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗原液与权利要求1～4任一项所述的稀释液的体积比为1:5～25。 说明书 : 猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液及其制备
方法技术领域[0001] 本发明属于生物制品技术领域，具体涉及猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液及其制备方法。背景技术[0002] 猪流行性腹泻(PorcineEpidemicDiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度接触性传染。砺肿床《静∈怯芍砺肿床《(PorcineRotavirus，RV)引起的一种接触性传染。街旨膊〉闹饕：谟谝鸪跎兄砀剐，从而造成仔猪脱水死亡，发病后耐过仔猪成为僵猪大大降低料肉比，从而给养殖户造成巨大的经济损失。目前这两种疾病常呈混合感染的方式，给养殖场造成更高的发病率和病死率，每年会给养殖场带来巨大的直接经济损失和间接经济损失。[0003] 目前针对PEDV和RV均无特异性治疗药物，最为经济有效的方法是使用疫苗进行免疫防控。仔猪发病时期多为出生半月内，出生半月内的仔猪自身免疫系统尚未成熟，此时对仔猪进行PEDV和RV的免疫其效果甚微，因此仔猪需要通过初乳获得母源抗体从而获得PEDV和RV的被动免疫保护，初乳中最重要的免疫因子是IgG和IgA，其中IgA主要是保护仔猪肠道和其他黏膜组织不受病原微生物的侵袭，是PEDV和RV防控中最为关键的保护因子。母猪的胃肠道免疫与新生仔猪的保护是关联的，这就是肠道?乳腺?sIgA轴体系，该轴系的本质是指病原微生物侵染肠上皮细胞导致肠系膜淋巴结内产生了能够合成sIgA的淋巴浆母细胞，这些淋巴浆母细胞可回到肠道固有层，也可以转移至乳腺而发挥作用，被免疫的母猪乳腺上皮基底层的淋巴细胞可持续分泌型sIgA，且不容易被乳汁和肠道中的酶类降解，因此可以赋予仔猪持久的免疫保护。[0004] 因此，对于PEDV和RV的防控采用传统的灭活疫苗或者活疫苗进行注射免疫时，无法为仔猪提供具有保护效果的分泌型sIgA，临床应用结果也表明使用毒力适中的活毒口服免疫能有效地对PEDV和RV进行防控。但是由于胃内的pH值很低，有活性的病毒(免疫原)被母猪摄入后极容易失活或被降解，使其无法到达小肠内并发挥有效的免疫保护效果。发明内容[0005] 本发明的目的在于提供猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液及其制备方法，该猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液解决了口服猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联活疫苗经胃消化后疫苗失活或降解，无法实现免疫保护效果的问题。[0006] 为达到上述目的所采取的技术方案是，提供猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液，包括A组分和B组分；A组分与B组分的质量比为1.5～2.5:1；[0007] A组分包括以下质量份原料：氯化钠7.5～8.5份、氯化钾0.1～0.3份、磷酸二氢钠1.3～1.5份、磷酸二氢钾0.2～0.3份、海藻酸钠1～3份、壳聚糖1～3份、乳糖0.5～2份及水900～1100份；[0008] B组分包括以下质量份原料：黄连提取物30～90份、黄芪提取物20～60份、黄柏提取物20～60份、栀子提取物30～90份及水900～1100份。[0009] 本发明采用上述技术方案的有益效果为：本发明稀释液的A组分中海藻酸钠与壳聚糖可共同形成稳定的包埋结构，乳糖作为稳定剂以增强包埋结构的稳定性。海藻酸钠与壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性和生物活性，其中壳聚糖还具有一定凝胶性能和吸附性能；当猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗用本发明的稀释液稀释后，由于猪流行性腹泻病毒及猪轮状病毒带有负电荷，带有正电荷的壳聚糖分子可通过静电相互作用有效的捕获疫苗抗原，在固定抗原病毒的同时，通过交联等方式将其包裹于海藻酸钠与壳聚糖形成的包埋结构中；当口服疫苗进入胃内，呈碱性的壳聚糖可中和胃酸，在胃液中形成粘稠胶体液，并附在胃壁上形成保护膜以减少胃酸的侵蚀，此时海藻酸钠与壳聚糖的粘稠胶体液进一步形成具有保护性的凝胶覆盖层，可与不易被胃酸分解的乳糖共同作用，减缓或防止胃酸性条件下抗原病毒的降解或失活。海藻酸钠与壳聚糖还可以有效保障抗原病毒活性并控制其在小肠内的释放速率，实现持续、稳定的免疫刺激；乳糖还具有调节胃酸、促进胃肠蠕动和消化腺分泌等作用，与海藻酸钠和壳聚糖联合作用进一步提升病毒对胃酸的抵抗能力；此外乳糖微甜，可以提升口服疫苗的适口性，以便更好完成动物的口服免疫工作；[0010] 同时，B组分中的黄连提取物、黄芪提取物、黄柏提取物及栀子提取物与抗原病毒共同包埋于A组分形成的包埋结构中到达小肠，黄连及黄柏提取物可刺激免疫细胞的增殖和分化，通过与黄芪提取物混合作用，可有效增强免疫细胞的吞噬和杀伤能力，最后再辅以栀子提取物，可对免疫细胞传导进行调节，使得免疫应答更为精准高效，这种综合的协同增强效应可显著提升免疫细胞对病毒抗原的识别和清除能力，以进一步提升疫苗的免疫保护效果；同时，黄连提取物、黄芪提取物、黄柏提取物及栀子提取物共同作用可增强疫苗抗原的稳定性及溶解度、提高疫苗在小肠内的暴露量，增强疫苗与免疫细胞的相互作用，以提升疫苗的免疫应答能力；此外，黄连提取物、黄芪提取物、黄柏提取物及栀子提取物还可以起到抗氧化和抗炎作用，可减轻口服疫苗后可能出现的炎症反应和组织损伤，通过减少炎症因子的释放和氧化应激的产生，保护免疫细胞免受损伤，使得免疫应答更为持久和稳定，最终起到高效免疫保护作用。[0011] 优选的，A组分与B组分的质量比为2:1。[0012] 优选的，A组分包括以下质量份原料：氯化钠8份、氯化钾0.2份、磷酸二氢钠1.41份、磷酸二氢钾0.24份、海藻酸钠1～2份、壳聚糖1～2份、乳糖0.5～1份及水1000份。[0013] 更优选的，A组分包括以下质量份原料：氯化钠8份、氯化钾0.2份、磷酸二氢钠1.41份、磷酸二氢钾0.24份、海藻酸钠2份、壳聚糖2份、乳糖1份及水1000份。[0014] 优选的，B组分包括以下质量份原料：黄连提取物90份、黄芪提取物60份、黄柏提取物60份、栀子提取物90份及水1000份。[0015] 本发明还提供猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液的制备方法，包括以下步骤：[0016] (1)将A组分中的原料混合并调节pH为6.0～7.0，再灭菌，得A组分；[0017] (2)将B组分中的原料混合并灭菌，得B组分；[0018] (3)将A组分与B组分按质量比混合，即得。[0019] 优选的，步骤(1)中调节pH为6.0。[0020] 优选的，步骤(1)及步骤(2)中灭菌温度均为110～120℃，灭菌时间均为15～20min。[0021] 更优选的，步骤(1)及步骤(2)中灭菌温度均为116℃，灭菌时间均为15min。[0022] 本发明还提供一种猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗，包括猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗原液和上述的猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液。[0023] 更优选的，流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗原液与上述的猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液的体积比为1:5～25。[0024] 本发明具有以下有益效果：[0025] (1)本发明制备的猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液中的海藻酸钠、壳聚糖及乳糖均为无毒副作用、安全性良好的可生物降解物质，可实现抗原病毒的包埋，有效防止猪流行性腹泻病毒及猪轮状病毒在胃的酸性条件下的失活或降解，使其可以定向在小肠内释放，同时还起到缓释效果以实现持续、稳定的免疫刺激；同时添加的黄连提取物、黄芪提取物、黄柏提取物及栀子提取物均为中药提取成分，可产生协同作用进一步提升猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗的免疫效果。[0026] (2)本发明的猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液的制备方法简单，无需进行复杂的加工过程，同时材料较为便宜易得，适合大规模工业化生产。具体实施方式[0027] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步详细的描述。黄连提取物、黄芪提取物、黄柏提取物及栀子提取物均为颗粒剂，由江阴天江药业有限公司提供。[0028] 实施例1[0029] 猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液，包括A组分和B组分；A组分与B组分的质量比为2:1；[0030] A组分包括以下质量份原料：氯化钠8份、氯化钾0.2份、磷酸二氢钠1.41份、磷酸二氢钾0.24份、海藻酸钠2份、壳聚糖2份、乳糖1份及注射用水1000份；[0031] B组分包括以下质量份原料：黄连提取物90份、黄芪提取物60份、黄柏提取物60份、栀子提取物90份及注射用水1000份。[0032] 猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液的制备方法，包括以下步骤：[0033] (1)称取氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、海藻酸钠、壳聚糖及乳糖溶于800份的注射用水中，利用稀盐酸溶液调节溶液pH为6.0，再加入剩余质量份的注射用水，混合后置于116℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15min，冷却后得A组分；[0034] (2)称取黄连提取物、黄芪提取物、黄柏提取物及栀子提取物溶于1000份的注射用水中，置于116℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15min，冷却后得B组分；[0035] (3)将A组分与B组分按2:1的质量比混合，即得。[0036] 实施例2[0037] 猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液，包括A组分和B组分；A组分与B组分的质量比为2:1；[0038] A组分包括以下质量份原料：氯化钠8份、氯化钾0.2份、磷酸二氢钠1.41份、磷酸二氢钾0.24份、海藻酸钠1份、壳聚糖1份、乳糖0.5份及注射用水1000份；[0039] B组分包括以下质量份原料：黄连提取物30份、黄芪提取物20份、黄柏提取物20份、栀子提取物30份及注射用水1000份。[0040] 猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液的制备方法，包括以下步骤：[0041] (1)称取氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、海藻酸钠、壳聚糖及乳糖溶于800份的注射用水中，利用稀盐酸溶液调节溶液pH为6.0，再加入剩余质量份的注射用水，混合后置于116℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15min，冷却后得A组分；[0042] (2)称取黄连提取物、黄芪提取物、黄柏提取物及栀子提取物溶于1000份的注射用水中，置于116℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15min，冷却后得B组分；[0043] (3)将A组分与B组分按2:1的质量比混合，即得。[0044] 实施例3[0045] 猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液，包括A组分和B组分；A组分与B组分的质量比为2.5:1；[0046] A组分包括以下质量份原料：氯化钠8.5份、氯化钾0.3份、磷酸二氢钠1.5份、磷酸二氢钾0.3份、海藻酸钠3份、壳聚糖3份、乳糖2份及注射用水1100份；[0047] B组分包括以下质量份原料：黄连提取物90份、黄芪提取物60份、黄柏提取物60份、栀子提取物90份及注射用水1100份。[0048] 猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液的制备方法，包括以下步骤：[0049] (1)称取氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、海藻酸钠、壳聚糖及乳糖溶于800份的注射用水中，利用1.0MNaOH溶液调节溶液pH为6.5，再加入剩余质量份的注射用水，混合后置于110℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌20min，冷却后得A组分；[0050] (2)称取黄连提取物、黄芪提取物、黄柏提取物及栀子提取物溶于1100份的B组分注射用水中，置于110℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌20min，冷却后得B组分；[0051] (3)将A组分与B组分按2.5:1的质量比混合，即得。[0052] 实施例4[0053] 猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液，包括A组分和B组分；A组分与B组分的质量比为1.5:1；[0054] A组分包括以下质量份原料：氯化钠7.5份、氯化钾0.1份、磷酸二氢钠1.3份、磷酸二氢钾0.2份、海藻酸钠1份、壳聚糖1份、乳糖0.5份及注射用水900份；[0055] B组分包括以下质量份原料：黄连提取物30份、黄芪提取物20份、黄柏提取物20份、栀子提取物30份及注射用水900份。[0056] 猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液的制备方法，包括以下步骤：[0057] (1)称取氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、海藻酸钠、壳聚糖及乳糖溶于700份的注射用水中，利用1.0MNaOH溶液调节溶液pH为7.0，再加入剩余质量份的注射用水，混合后置于120℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15min，冷却后得A组分；[0058] (2)称取黄连提取物、黄芪提取物、黄柏提取物及栀子提取物溶于900份的注射用水中，置于120℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15min，冷却后得B组分；[0059] (3)将A组分与B组分按1.5:1的质量比混合，即得。[0060] 对比例1[0061] 猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液，包括以下质量份原料：氯化钠8份、氯化钾0.2份、磷酸二氢钠1.41份、磷酸二氢钾0.24份、海藻酸钠2份、壳聚糖2份、乳糖1份及注射用水1000份。[0062] 猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液的制备方法，包括以下步骤：[0063] 称取氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、海藻酸钠、壳聚糖及乳糖溶于800份的注射用水中，利用稀盐酸溶液调节溶液pH为6.0，再加入剩余质量份的注射用水，混合后置于116℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15min，冷却后即得。[0064] 对比例2[0065] 猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液，包括以下质量份原料：黄连提取物90份、黄芪提取物60份、黄柏提取物60份、栀子提取物90份及注射用水1000份。[0066] 猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液的制备方法，包括以下步骤：[0067] 称取黄连提取物、黄芪提取物、黄柏提取物及栀子提取物溶于1000份的注射用水中，置于116℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15min，冷却后即得。[0068] 对比例3[0069] 猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液，包括A组分和B组分；A组分与B组分的质量比为2:1；[0070] A组分包括以下质量份原料：氯化钠8份、氯化钾0.2份、磷酸二氢钠1.41份、磷酸二氢钾0.24份、海藻酸钠2份、壳聚糖2份、乳糖1份及注射用水1000份；[0071] B组分包括以下质量份原料：黄连提取物90份、黄芪提取物60份及注射用水1000份。[0072] 猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗稀释液的制备方法，包括以下步骤：[0073] (1)称取氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、海藻酸钠、壳聚糖及乳糖溶于800份的注射用水中，利用稀盐酸溶液调节溶液pH为6.0，再加入剩余质量份的注射用水，混合后置于116℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15min，冷却后得A组分；[0074] (2)称取黄连提取物及黄芪提取物溶于1000份的注射用水中，置于116℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15min，冷却后得B组分；[0075] (3)将A组分与B组分按2:1的质量比混合，即得。[0076] 实验例免疫效果评价[0077] 1、猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗的制备[0078] 1.1猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗原液的制备[0079] 利用生物反应器和微载体悬浮培养技术对Vero细胞进行培养，待Vero细胞长满单层后，使用PBS对细胞进行洗涤，更换为含0.01MOIPEDV种毒和5μg/mL胰酶的维持液进行培养，待微载体上的细胞脱落50％以上时，收获病毒液，反复冻融3次去除微载体，收集上清液使用1μm的滤膜过滤去除细胞碎片，再使用100kD的膜包进行洗滤后作为PEDV抗原液；对抗原液进行病毒含量检测、无菌检验、支原体检验及外源病毒检测等，各项检验符合规定后方可用于后续冻干。[0080] 1.2猪轮状病毒(RV)抗原液的制备[0081] 利用生物反应器和全悬浮培养技术对Marc?145细胞进行培养，待Marc?145细胞长满单层后，加入0.01MOIRV种毒和2μg/mL胰酶的维持液进行培养，待细胞活性降低至40％以下时，反复冻融3次，再使用1μm的滤膜过滤去除细胞碎片，再使用100kD的膜包进行洗滤后作为RV抗原液；对抗原液进行病毒含量检测、无菌检验、支原体检验及外源病毒检测等，各项检验符合规定后方可用于后续冻干。[0082] 1.3猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗的冻干[0083] (1)冻干保护剂的制备：称取400g蔗糖及80g明胶溶解于800mL注射用水中，充分溶解后定容至1000mL，置于121℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌30min；[0084] (2)病毒抗原液的配制：使用0.01mol/LPBS对PEDV病毒液和RV病毒液进行稀释，7.3稀释至病毒含量为10 TCID50/mL；将稀释后的两种病毒液按等体积进行混合，作为病毒抗原液；[0085] (3)活疫苗的冻干：将病毒抗原液与冻干保护剂按7:1的比例进行混合，分装为2mL/瓶后使用真空冻干机进行冷冻干燥；[0086] (4)冻干后的检验：将冻干后的活疫苗分别进行病毒含量检测、无菌检验、支原体及外源病毒检验等，应均符合规定，即得冻干疫苗。[0087] 2、仔猪免疫效果[0088] 2.1磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)的制备[0089] 称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.41g，磷酸二氢钾0.24g，溶解于800mL注射用水中，充分溶解后调节pH值至7.0，定容至1000mL，在将其置于116℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌15min，冷却后备用。[0090] 2.2活疫苗的稀释[0091] 分别使用实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3制备的稀释液及PBS缓冲液对同一批次猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗进行稀释，稀释时分别使用10mL和50mL稀释一瓶冻干疫苗，用于仔猪的免疫。[0092] 2.3仔猪免疫效果评价[0093] (1)仔猪免疫：选取14～21日龄健康易感仔猪(PEDV抗原抗体阴性、RV抗原抗体阴性)180只，随机分为10组，每组10头，分别口服免疫不同稀释液配方及两种不同体积稀释液稀释后的疫苗，每头口服2mL；同时设置仅口服稀释液的对照组及口服PBS的对照组；具体分组及免疫情况见表1。[0094] 表1实验仔猪分组及免疫情况[0095][0096] (2)免疫仔猪抗体测定：仔猪口服免疫后第14d、第21d及第28d分别采血，分离血清后进行抗体测定，分别测定血清中PEDV和RV抗体；结果如表2～3所示，从表2～3中可以看出，使用不同配方的稀释液及不同体积稀释液稀释PEDV+RV口服二联活疫苗后，仔猪在免疫后两种病毒的抗体均于14d抗体开始转阳，到免疫后28d抗体阳性率达到较高水平。使用不同体积进行实施例1稀释液稀释活疫苗组各时间点的抗体阳性率最高，其次为实施例2稀释活疫苗组；对比例1和对比例3活疫苗组抗体阳性率基本相当，优于对比例2稀释活疫苗组。[0097] 表2PEDV抗体效价测定结果[0098][0099][0100] 表3RV抗体效价测定结果[0101][0102][0103] (3)免疫仔猪攻毒保护试验：仔猪口服免疫后第28d，每组任选5头仔猪使用PEDV强4.0毒对实验仔猪进行PEDV攻毒，攻毒剂量为10 MID；剩余5头仔猪使用RV强毒对试验仔猪进4.0行攻毒，攻毒剂量为10 MID；不同强毒进行攻毒后的仔猪分开在不同区域进行饲养管理。PEDV攻毒后连续观察7d，并于攻毒后第4d采集所有仔猪肛拭子进行PEDV的荧光定量PCR检测排毒量；由于大日龄仔猪在使用RV强毒进行单独感染后多数不引起典型临床症状，故分别于免疫前、第1d、第4d和第7d采集肛拭子进行荧光定量PCR检测排毒量；检测结果如表4～5所示。由表4可知，使用PEDV强毒进行攻毒后，实施例1和实施例2制备的稀释液稀释活疫苗组的发病率最低，且攻毒后4d肛拭子的中均未检测到病毒；而对比例1和对比例3稀释活疫苗口服免疫组攻毒后的发病率及排毒量基本相当，均优于对比例2稀释活疫苗组；由表5可知，使用RV强毒进行攻毒后，实施例1和实施例2稀释活疫苗口服免疫后攻毒后1～7d肛拭子荧光检测阳性以及排毒量均为最低；而对比例1和对比例3稀释活疫苗口服免疫组攻毒后1～7d肛拭子荧光检测阳性以及排毒量基本相当，均优于对比例2稀释活疫苗组。[0104] 表4PEDV攻毒保护试验结果[0105][0106][0107] 表5RV攻毒保护试验结果[0108][0109][0110] 3、怀孕母猪临床免疫效果[0111] 在受PEDV和RV感染威胁的猪场分别使用PEDV+RV二联活疫苗和实施例1、对比例3制备的稀释液对怀孕母猪进行免疫，观察母猪在免疫后到生产前1天是否出现精神食欲不振、呕吐、腹泻等临床症状，统计其所产仔猪在14日龄内的健活率；具体免疫及分组情况见表6。[0112] 表6怀孕母猪临床免疫情况[0113][0114] 怀孕母猪临床免疫效果评价结果见表7，从表7中可以看出，在受PEDV和RV感染威胁的猪场分别使用实施例1制备的稀释液稀释PEDV+RV二联活疫苗、实施例1制备的稀释液以及对比例3制备的稀释液稀释PEDV+RV二联活疫苗对怀孕母猪进行免疫，观察临床症状并统计仔猪在14日龄内的健活率；结果显示：母猪在口服接种实施例1稀释后的猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗后未出现临床症状的母猪比例为93.06％，其所产仔猪在14日龄内的健活比例为84.12％；而口服实施例1的稀释液的母猪免疫后未出现临床症状的比例为40％，其所产在14日龄内的健活比例为33.04％；口服对比例3稀释液稀释猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗后未出现临床症状的母猪比例为50％，其所产仔猪在14日龄内的健活比例为49.30％；对照组(仅服用PBS缓冲液)未出现临床症状的母猪比例为30％，其所产仔猪在14日龄内的健活比例为16.59％；结果表明使用实施例1稀释液稀释PEDV+RV二联活疫苗后对怀孕母猪进行口服免疫后，母猪发生临床症状的比例显著低于其它组，其次为对比例3稀释液稀释活疫苗组及单独口服实施例1稀释液。对于稀释液+二联活疫苗口服免疫组，母猪出现临床症状主要集中于免疫后1～3周内，仔猪出现临床症状的时间多集中于怀孕母猪免后1～4周内所产仔猪，主要原因是由于疫苗免疫后到产生有效保护性需要一定的时间。[0115] 表7怀孕母猪临床免疫效果评价结果[0116] 组别 数量 未出现临床症状母猪比例 仔猪14日龄健活比例免疫组1 72头 93.06％(67/72) 84.12％(694/825)免疫组2 20头 40％(8/20) 33.04％(70/227)免疫组3 20头 50％(10/20) 49.30％(138/219)对照组 20头 30％(6/20) 16.59％(34/205)[0117] 综上，使用不同配方的稀释液对猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗进行稀释后进行实验室评价和临床评价，结果显示：综合免疫后的抗体水平及保护效果，排序分别为实施例1稀释液＝实施例2稀释液＞对比例1稀释液＝对比例3稀释液＞对比例2稀释液＞PBS缓冲液，即含海藻酸、壳聚糖、乳糖成分的稀释液A组分与四种中药成分的B组分联合使用时效果最佳，而单独使用A组分或B组分以及中药成分减少时不能达到最佳效果。[0118] 将实施例1和对比例3制备的稀释液分别对猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗进行稀释后口服免疫受疫病感染威胁的母猪，结果显示实施例1制备的稀释液无论是对于母猪的自身保护效果还是其所产仔猪的保护效果均为最佳；而减少中药成分的对比例3的效果低于实施例1稀释活疫苗组，单独口服实施例1稀释液组母猪和仔猪的保护效果高于未做任何处理的对照组，该结果与实验室评价结果基本一致。试验结果表明，稀释液配方中B组分对于提升母猪非特异性免疫及其所产仔猪的保护效果具有促进作用，而稀释液配方中A组分和B组分联合才能使猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联口服活疫苗不被胃酸降解或失活，最大程度发挥其免疫保护效果。[0119] 本发明按照上述实施例进行了说明，应当理解，上述实施例不以任何形式限定本发明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的包含范围之内。

专利地区：四川

专利申请日期：2024-06-04

专利公开日期：2024-10-08

专利公告号：CN118743752A