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专利名称：一种肉桂醛硫代氨基脲锌配合物及其制备方法和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310973425.X

专利申请（专利权）人：右江民族医学院
权利人地址：广西壮族自治区百色市右江区城乡路98号

专利发明（设计）人：发明人:黄衍强,李琛妍,黄干荣,罗家锱

专利摘要：一种肉桂醛硫代氨基脲锌配合物及其制备方法和应用，本发明经细胞增殖、细胞克隆形成、细胞划痕、细胞凋亡和细胞周期等实验证明所发明化合物可有效抑制舌癌CAL27细胞的增殖，抑制肿瘤细胞克隆形成，增加CAL27细胞内活性氧的含量，具有显著的抗舌癌活性。本发明为研制新型抗肿瘤药物提供了依据，具有很好的临床运用前景。所述肉桂醛硫代氨基脲锌（II）配合物可以作为药物有效成分，加以药物学上可接受的载体，制备抗舌癌的药物组合。

主权利要求：
1.肉桂醛硫代氨基脲锌配合物 在制备抗舌癌药物中的应用。
2.抗舌癌药物，其特征在于，有效成分含有肉桂醛硫代氨基脲锌配合物。 说明书 : 一种肉桂醛硫代氨基脲锌配合物及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物及其制备方法和制备抗舌癌药物中的应用。背景技术[0002] 头颈部鳞状细胞癌(headandnecksquamouscellcarcinoma,HNSCC)是最常见的第七种癌症，其中，口腔鳞状细胞癌(oralsquamouscellcarcinoma,OSCC)是最常见的头颈部鳞状细胞癌，大约占到口腔癌的90％左右，发生在唾液腺、上颌窦、颌骨、口腔、口咽等部位，恶性程度高。舌鳞状细胞癌(TongueSquamousCellCarcinoma,TSCC)又在口腔鳞状细胞癌中的发病率居首位，约占口腔恶性肿瘤的43.4％，其中以发生在舌侧缘者最多，其次为舌尖、舌背及舌根等部位。大多数患者最主要表现出的是舌头灼烧感或者疼痛的症状，其他的症状包括溃疡及肿块。咀嚼槟榔是TSCC的首要危险因素。同时，饮酒、吸烟以及HPV感染也与包括TSCC在内的恶性肿瘤有关。[0003] 由于舌部血管和淋巴丰富，因此舌癌容易发生颈部和远处淋巴结转移。同时早期的TSCC较隐匿，且缺少特异性的分子标志物，而晚期TSCC虽然存在明显的溃疡或肿块等症状可以通过病理学方法确诊，但是，从癌前病变进展为浸润性癌的过程中，往往没有任何特殊的症状，这会导致延误诊断及预后不良。化疗是晚期即III?IV期舌癌的治疗方法，可使肿瘤组织周围的淋巴管堵塞，从而可以阻止癌细胞的扩散，控制局部和区域复发率，提高总体生存率。总之，肿瘤细胞的转移及放化疗的痛苦给其治疗带来很大挑战，因此迫切需要开发副作用小、疗效高的新型抗TSCC药物来提高患者的生存质量。[0004] 肉桂醛(cinnamaldehyde,CA)是一种醛类有机化合物，淡黄色液体，可从桂皮油中分离而得。研究发现肉桂醛在临床抗肿瘤方面具有较大研究潜力，可通过不同途径对乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、肺癌、宫颈癌等产生抑制作用。缩氨基硫脲是由氨基硫脲与适当的醛或酮缩合得到的一类具有广泛生物活性的化合物，具有良好的抗菌、抗癌、抗病毒和抗疟疾活性，而其中的硫羰基能和多种金属离子形成稳定的配合物进一步增强其作用。[0005] 本发明涉及肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物在药物领域中的应用，现有技术中没有本发明提供的肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物及其作为抗舌癌有效成分的药物的报道，也没有关于该化合物或其与其它药物组合对治疗肿瘤的报道。发明内容[0006] 解决的技术问题：本发明针对上述技术问题，提供一种肉桂醛硫代氨基脲锌配合物及其制备方法和应用。[0007] 技术方案：一种肉桂醛硫代氨基脲锌配合物，结构式如下所示：[0008][0009] 肉桂醛硫代氨基脲锌配合物的制备方法，步骤为：按如下比例，称取0.76mmoL肉桂醛溶于1.5mL无水乙醇中，加入0.76mmol氨基硫脲，加入0.15mmol无水硫酸钠置于反应容器中，将混合物加热搅拌回流12小时并在0℃放置过夜；滤出沉淀，用乙醇洗涤并冷冻干燥，得到肉桂醛?硫代氨基脲；将0.12mmol肉桂醛?硫代氨基脲与0.26mmol二水合乙酸锌(II)在2mL乙醇中混合，金属与配体的摩尔比为1:2；将混合物在室温下搅拌2小时；溶液逐渐变色并且产物在反应过程中沉淀；最后，滤出固体，用石油醚洗涤两次，然后冷冻干燥，得到肉桂醛硫代氨基脲锌配合物。[0010] 上述肉桂醛硫代氨基脲锌配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。[0011] 上述肉桂醛硫代氨基脲锌配合物在制备抗舌癌药物中的应用。[0012] 抗肿瘤药物，有效成分含有上述肉桂醛硫代氨基脲锌配合物。[0013] 抗舌癌药物，有效成分含有上述肉桂醛硫代氨基脲锌配合物。[0014] 有益效果：本发明经细胞增殖、细胞克隆形成、细胞划痕、细胞凋亡和细胞周期等实验证明所发明化合物可有效抑制舌癌CAL27细胞的增殖，抑制肿瘤细胞克隆形成，增加CAL27细胞内活性氧的含量，具有显著的抗舌癌活性。本发明为研制新型抗肿瘤药物提供了依据，具有很好的临床运用前景。所述肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物可以作为药物有效成分，加以药物学上可接受的载体，制备抗舌癌的药物组合。附图说明[0015] 图1为肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物制备线路。[0016] 图2为肉桂醛硫代氨基脲傅里叶红外分析：1624cm?1对应的是C＝N双键的伸缩振动?1吸收峰，C＝S双键的伸缩振动吸收峰出现在820cm 。红外光谱分析说明所合成的配体为肉桂醛硫代氨基脲。[0017] 图3为肉桂醛硫代氨基脲质谱鉴定；LC?MS(+)m/zcalc.206.0674found206.0637。[0018] 图4为肉桂醛硫代氨基脲核磁鉴定(氢谱)；1HNMR(400MHz,DMSO?d6)δH11.40(s,1H),8.18(s,1H),7.89(d,J＝9.2Hz,1H),7.62(s,1H),7.55(d,J＝7.3Hz,2H),7.41–7.36(m,2H),7.35–7.29(m,1H),7.02(d,J＝16.1Hz,1H),6.87(dd,J＝16.1,9.2Hz,1H)。[0019] 图5为肉桂醛硫代氨基脲核磁鉴定(碳谱)；13CNMR(101MHz,DMSO?d6)δC177.7，144.8，138.9，135.9，128.9，128.9，128.9，127.0，125.1。[0020] 图6为肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物傅里叶红外分析；1627cm?1处的吸收峰为?1NH2的变角振动和C＝N的伸缩振动，C＝S双键在820cm 处的吸收消失。[0021] 图7为肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物质谱鉴定；ESI?ESI?MS(+)m/zcalc.473.0482found475.0693。[0022] 图8为肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物核磁鉴定(氢谱)；1HNMR(400MHz,DMSO?d6)δH8.27(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.45–7.32(m,7H),7.15–6.97(m,2H)。[0023] 图9为肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物核磁鉴定(碳谱)；13CNMR(150MHz,DMSO?d6)δC173.3，151.6，140.4，135.7，129.4，129.1，129.1，127.1，127.1，123.7。[0024] 图10为肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物对CAL27细胞增殖的影响。[0025] 图11为建立异位瘤BALB/c裸鼠模型检测肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物对CAL27细胞体内增殖的影响。[0026] 图12为肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物治疗后CAL27异位瘤BALB/c裸鼠模型肿瘤重量差异。[0027] 图13为肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物治疗后CAL27异位瘤BALB/c裸鼠模型肿瘤体积差异。[0028] 图14为分离原代细胞后给药前后细胞生长速度的差异。[0029] 图15为克隆形成试验评估肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物对CAL27细胞增殖的影响。[0030] 图16为细胞划痕实验评估肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物在体外条件下对CAL27细胞迁移能力的抑制作用。[0031] 图17肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物作用于CAL27细胞后细胞内活性氧ROS的含量。具体实施方式[0032] 实施例1化合物的合成及结构鉴定[0033] 肉桂醛?硫代氨基脲的制备方法，其包括如下步骤：[0034] 称取肉桂醛(100mg，0.76mmoL)溶于1.5mL无水乙醇中，加入等摩尔量的氨基硫脲(69.3mg,0.76mmol)，加入适量无水硫酸钠(21.3mg，0.15mmol)置于圆底烧瓶中，烧瓶置于硅油中。将混合物加热搅拌回流12小时并在0℃放置过夜。滤出沉淀，用冷乙醇洗涤并冷冻干燥，得到淡黄色粉末，产率约为84.91％。产物经核磁共振氢谱、碳谱，液质联用仪鉴定为肉桂醛?硫代氨基脲。[0035] 肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物的制备方法，其包括如下步骤：[0036] 将肉桂醛?硫代氨基脲(25mg，0.12mmol)与二水合乙酸锌(II)(57.51mg，0.26mmol)在2mL乙醇中混合，金属与配体的比例为1:2。将混合物在室温下搅拌2小时。溶液逐渐变色并且产物在反应过程中沉淀。最后，滤出固体，用石油醚洗涤两次，然后冷冻干燥，得到黄色粉末，产率约为44.39％。产物经核磁共振氢谱、碳谱，液质联用仪鉴定为肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物。[0037] 实施例2肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物对CAL27细胞增殖活性的研究[0038] 1.材料[0039] 1.1样品[0040] 肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物实施例1制备，制备和鉴定结果如图1?9所示。[0041] 1.2细胞株[0042] 本研究使用的细胞为人源舌癌CAL27细胞，为右江民族医学院莫小强教授馈赠。用含10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃、体积分数为5％CO2、完全饱和湿度条件下空气中常规培养，实验选用对数生长期细胞。[0043] 1.3主要培养基和试剂：DMEM培养基、双抗(青霉素/链霉素)、新鲜胎牛血清、胰酶、磷酸盐缓冲液1×PBS、4％甲醛固定液、结晶紫染色液等。[0044] 1.4主要仪器：细胞培养箱、离心机、酶标仪、电子天平等。[0045] 1.5耗材：EP管、离心管、细胞培养所需的6孔板、12孔板、24孔板、96孔板等。[0046] 2.方法与结果[0047] 2.1MTT法检测肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物对CAL27细胞增殖的影响[0048] (1)取对数生长的CAL?27细胞，胰酶消化，计数，将2×104个细胞均匀接种在96孔板，每孔体积100μL，将其分为实验组和对照组，边缘以无菌PBS封闭，放入37℃、5％CO2的细胞恒温培养箱中孵育24h。[0049] (2)吸弃培养基，加入浓度梯度肉桂醛?硫代氨基脲、肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物、顺铂溶液(0.5、1、5、10、20μmol/L)继续孵育24h。[0050] (3)孵育后，吸弃旧培养基，避光，每孔加MTT溶液10μL，避光孵育4h后，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150μLDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。用酶标仪在490nm处检测吸光度(OD值)。并计算细胞抑制率和半数抑制浓度(IC50)。[0051] (4)抑制率＝1?加药组OD值/对照组OD值[0052] (5)结果显示：化合物(I)对CAL27细胞具有较强的增殖抑制作用，其IC50为1.642?2.223μmol/L。细胞增殖抑制活性见图10。[0053] 2.2建立异位瘤BALB/c裸鼠模型检测肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物对CAL27细胞体内增殖的影响[0054] (1)实验动物饲养：50只雌性SPF级BALB/c裸鼠(5?6周龄，体重18?22g)，购买于维通利华实验动物技术有限公司。自由摄水和饮食，在安静环境下进行实验。[0055] (2)细胞培养：准备构建异位瘤BALB/c裸鼠模型时所需的CAL27细胞，在培养过程中为保证荷瘤成功率，注意保证细胞处于良好的状态并准备充足的细胞数量。[0056] (3)构建异位瘤BALB/c裸鼠模型：将CAL27细胞以2×107个/mL的浓度接种于BALB/c裸鼠的左侧腋下皮下，每只裸鼠注射细胞悬液100μL。[0057] 荷瘤完成后，每2天检测成瘤情况。[0058] (4)制定给药方案：CAL27异位瘤成瘤后，将裸鼠随机分成4组(n＝6)，分别为对照组、顺铂2.5mg/kg组、肉桂醛2.5mg/kg组、肉桂醛10mg/kg组。对照组腹腔注射含有不高于0.1％DMSO的生理盐水。药物组腹腔注射含有不高于0.1％DMSO且终浓度为2.5mg/kg的顺铂组，2.5mg/kg、0.625mg/kg的肉桂醛药物组。每天进行给药，连续给药14天，同时监测肿瘤体积及裸鼠体重的变化。[0059] (5)最后1次给药后，第二天给予BALB/c裸鼠安乐死。测量肿瘤体积、拍照。肿瘤体2积＝长(mm)×[宽(mm)]×0.5。[0060] (6)结果显示：化合物(I)对CAL27异位瘤裸鼠具有较强的抑制作用。体内抑制活性见图11?13。[0061] 2.3分离原代细胞后给药前后细胞生长速度的差异。[0062] (1)处死裸鼠后，迅速剥离瘤组织并用含抗生素的PBS缓冲液反复冲洗2～3次，去3除血液、脂肪及坏死组织。用眼科剪将肿瘤组织块剪成约0.5～1mm的小块，加入适量PBS缓冲液反复冲洗，直至液体不再混浊。[0063] (2)将组织块间距0.5cm左右均匀地放置于培养皿内表面，加入适量细胞培养基，使培养基浸没组织块底部，放入37℃、5％CO2的细胞恒温培养箱中。[0064] (3)培养24h后，观察组织块贴壁情况，去除未贴壁的组织块，加入细胞培养基，使培养基完全浸没组织块，继续放入37℃、5％CO2的细胞恒温培养箱中培养。[0065] (4)培养1～2周后，可观察到细胞从组织块边缘长出，并形成生长晕，待细胞生长至70％时，去除组织块，细胞传代培养。[0066] (5)传代后，用血清饥饿法培养，去除混杂的成纤维细胞，分离和培养出药物作用组的CAL27细胞株。根据细胞生长状态，传代2～3次后，再进行后续的实验。[0067] (6)将分离培养后的细胞胰酶消化重悬，接种于六孔板，每孔接种细胞1×105个，在二氧化碳恒温培养箱中孵育24h、48h和72h，并分别在这3个时间段，在倒置显微镜下进行拍照记录。[0068] (7)结果显示：原代细胞给药后细胞生长速度缓慢，见图14。[0069] 2.4克隆形成试验评估肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物对CAL27细胞增殖的影响。[0070] (1)取对数期CAL27细胞，胰酶消化重悬，接种于六孔板，每孔接种细胞700个，设3个重复组，于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，分别加入浓度为0、1、5、10μmol/L的肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物，培养基每2天更换一次，连续培养14天。[0071] (2)实验结束后，吸弃培养基，用PBS轻柔洗涤1次，用体积分数为4％的多聚甲醛固定细胞20min，用PBS轻柔洗涤2次，每孔加入质量分数为0.5％的结晶紫1mL，作用15min，PBS洗涤直至将非细胞部分冲洗干净为止，培养板晾干后拍照、记录细胞(大于50个细胞为一个克隆)克隆数目并计算细胞克隆形成率。[0072] (3)克隆形成率(100％)＝(实验组细胞克隆数/细胞接种数)×100％。[0073] (4)结果显示，化合物(I)刺激CAL27细胞后，显著抑制CAL27细胞的克隆形成。结果见图15。[0074] 2.5细胞划痕实验评估肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物在体外条件下对CAL27细胞迁移能力的抑制作用[0075] (1)将处于对数生长期的CAL27细胞接种于6孔板内，5×105个细胞/孔，2mL培养基/孔。放入37℃、5％CO2的细胞恒温培养箱中孵育24h。[0076] (2)细胞铺满底壁，用20μL移液枪的枪头在培养皿底部均匀划线，用PBS冲洗3次至无死细胞或细胞碎片在孔中，分别用含0、1、5、10μmol/L的肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物的无血清培养基处理实验组细胞，用含0.01％DMSO的无血清培养基处理对照组细胞。在二氧化碳恒温培养箱中孵育0h、12h、24h和48h，并分别在这3个时间段，在倒置显微镜下进行拍照记录。拍照结束后用imageJ软件进行分析，来评价RLZ对口腔鳞癌细胞迁移的抑制效果。[0077] (3)结果显示肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物能显著抑制CAL27细胞的迁移能力，且呈浓度依赖性，结果见图16。[0078] 2.6细胞内活性氧ROS的检测[0079] (1)取对数生长期的CAL27细胞，以每孔1×105个细胞接种于24孔板。培养24h后，分别加入不同浓度(1μM、5μM、10μM)的肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物及50μg/mL的Rosup。每组设置三个复孔，同时设置阴性对照及阳性对照。[0080] (2)置于5％CO2,37℃继续培养至24h后，吸弃上清，每孔加入终浓度为10μM的荧光探针DCFH?DA500μL，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。[0081] (3)用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH?DA。然后使用荧光显微镜观察。[0082] (4)由图17可知，肉桂醛硫代氨基脲锌(II)配合物能增加CAL27细胞内活性氧的含量，且细胞内活性氧的产生与其浓度成正相关系，而阴性对照组细胞几乎无ROS产生。

专利地区：广西

专利申请日期：2023-08-03

专利公开日期：2024-10-08

专利公告号：CN117229186B