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专利名称：一种缓解蓝光伤害的组合物

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410903854.4

专利申请（专利权）人：飞鹤(吉林)乳品有限公司,黑龙江飞鹤乳业有限公司
权利人地址：吉林省白城市镇赉县工业街西幸福路北

专利发明（设计）人：郑成栋,解庆刚,陆思宇,李凯风,陈勇,蒋士龙,张永久,冷友斌

专利摘要：本发明属于功能性营养物质研究技术领域，具体涉及一种缓解蓝光伤害的组合物。该组合物包含如下必要组分：1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯和牛磺酸；并且，在所述组合物中，所述1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯与所述牛磺酸的质量比为500:(13.42~42.2)。相比单独的OPO或牛磺酸，本发明提供的组合物可以更加有效的缓解蓝光伤害；尤其的，可以有效清除由蓝光照射产生的活性氧自由基，减少眼部脂质氧化产物的含量，增加抗氧化酶的活力，减少促炎因子IL?1β基因il?1β的相对表达量，抑制炎症的发生，并且改善眼部受损组织的结构和状态。

主权利要求：
1.一种组合物在制备有助于缓解蓝光伤害的食品中的用途；
所述组合物包含如下必要组分：
1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯和牛磺酸；
并且，在所述组合物中，所述1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯与所述牛磺酸的质量比为
500:(13.42 42.2)。
~
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述有助于缓解蓝光伤害包括减少眼部细胞凋亡、降低眼部活性氧自由基积累、减少眼部脂质氧化产物含量、提高眼部抗氧化酶活力、降低基因il?1β表达量和改善眼部组织结构中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述脂质氧化产物包括丙二醛。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述抗氧化酶包括过氧化氢酶。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述改善眼部组织结构包括使眼睛尺寸恢复、使视网膜呈层级结构排列有序、使色素上皮层变厚且不出现色素弥散、使视锥和视杆细胞层细胞排列规则和使外核层和内核层细胞排列规则中的至少一种。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的用途，其特征在于，在常温条件下，所述食品为固~态乳制品或液态乳制品。
7.根据权利要求1 5中任一项所述的用途，其特征在于，所述食品为婴幼儿食品。
~
8.根据权利要求1 5中任一项所述的用途，其特征在于，所述食品为儿童食品。
~
9.根据权利要求1 5中任一项所述的用途，其特征在于，所述食品中还含有如下成分中~的任意一种或多种：植物制品成分、动物乳制品成分、动物肉制品成分、功能性添加成分和任意的可接受的辅料。 说明书 : 一种缓解蓝光伤害的组合物技术领域[0001] 本发明属于功能性营养物质研究技术领域，具体涉及一种缓解蓝光伤害的组合物。背景技术[0002] 蓝光是指波长介于400nm 500nm的短波长光，它是自然光线的重要组成部分。~蓝光在维持正常视觉和人体健康中发挥重要作用，在视知觉和颜色视觉中扮演重要角色。蓝光还参与瞳孔光反射和瞳孔收缩，此外还参与调节生物钟，因此适量的蓝光照射有助于健康，如提高警觉感、提高记忆功能、调节情绪和增加幸福感等。但是从另外一方面讲，蓝光能量高，穿透力强，因此能够穿透晶状体而到达视网膜，并对视网膜造成蓝光伤害。蓝光伤害主要表现在加速视网膜黄斑区细胞的氧化损伤，造成视网膜退行性改变，形成光致视网膜炎，对人眼视网膜造成不可逆损伤，甚至致盲。除了自然来源的蓝光外，人造光源如发光二极管（lightemittingdiode，LED）也是蓝光的一个重要来源。LED主要通过蓝光芯片激发黄光荧光粉发出白光，因此在高色温的情况下，光源光谱会存在一个很强的蓝光波峰。随着相关技术的高速发展，LED目前具有长寿命、小体积、高亮度、低能耗等优点，正因为此，它被广泛应用于日常生活中，包括儿童玩具、各种灯具以及各种屏幕电子产品等。据统计，目前市场上90%的光电玩具都使用了LED；而无论是线上学习的需要，还是常规教学学习的需要，很多情况下都会有通过台式电脑、平板电脑甚至智能手机来进行教学或者学习的环节，因此儿童在参与此类教学活动的过程中会接受大量的蓝光照射。而儿童对于光源：Φ娜现芰Σ蛔，且由于天然的好奇心，因此更易遭受蓝光伤害，造成对视力的不可逆的损伤。[0003] 对蓝光的防护手段主要包括物理防护和化学防护方法。物理防护主要是通过防蓝光眼镜、防蓝光屏幕、防蓝光膜等来对蓝光起到物理阻隔的作用。物理手段的确可以阻隔部分蓝光到达人眼，一定程度上减轻了使用数字设备时的眼疲劳症状，并且也可能保护视网膜免受蓝光的伤害，但是同时也干扰了蓝光对于正常视觉功能以及生理调节的正面作用。化学防护方法主要是通过服用抗氧化剂、自由基清除剂甚至抗炎药物进行相关的防护和治疗。由于视网膜细胞和晶状体上皮细胞受蓝光照射后会产生单线态氧或超氧阴离子等自由基，因而对眼部细胞和组织产生氧化胁迫。而抗氧化剂或者自由基清除剂则可抑制氧化应激效应的积累。例如，叶黄素可保护细胞免受光氧化和光破坏，可作为一种活跃的高能蓝光过滤器为生物体提供抗氧化保护。维生素E能一定程度上清除由蓝光照射而产生的活性氧自由基（ROS），而维生素C也能在一定程度上防止细胞氧化损伤，进而防止蓝光照射对细胞线粒体DNA造成损伤。蓝光照射导致ROS产生并积累的同时，可促进炎性因子的释放，因而提示我们使用抗炎药物也能缓解蓝光照射对眼睛造成的损伤。化学防护方法既不会干扰蓝光的正常生理功能，又能有针对性的对蓝光伤害起到缓解作用。[0004] 1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯（OPO）是母乳脂类中的重要成分，其棕榈酸位于Sn?2位上。在消化道中，Sn?1和Sn?3位的脂肪酸在胰脂肪酶的分解作用下被释放出来而形成游离脂肪酸，而Sn?2位上的棕榈酸仍然连在甘油基上一起被肠道吸收。因此，这一过程中不会产生游离的棕榈酸，不会与肠道中的阳离子，如钙离子和镁离子等形成不溶性皂而影响婴儿对于钙等的吸收，因此也不会使婴儿的粪便变硬，增加便秘和腹痛的风险。正因为如此，目前OPO结构脂被广泛添加于婴幼儿配方奶粉中，帮助提高奶粉中营养元素的吸收率、减少便秘等不适，更进一步模拟母乳功能。目前并未发现有公开OPO在修复蓝光伤害方面的报道。[0005] 牛磺酸是存在于生物体内的一种稳定的内源性含硫氨基酸。牛磺酸广泛分布于人和动物的多种组织和器官中，以骨骼肌和心脏中含量较高。此外，哺乳动物的乳汁中也存在一定含量的牛磺酸，是婴幼儿生长发育的必须营养素。研究表明，牛磺酸作为人体的条件必需氨基酸，具有增强免疫力、缓解疲劳、抗氧化、促进脂肪代谢、保护神经系统、改善记忆等多种生物功能。引用文献1公开了一种缓解视疲劳的保健食品及其制备方法，该保健品组合物中包含牛磺酸、葡萄糖酸锌、叶黄素、越橘提取物、维生素E以及维生素C等。但其并未通过试验证实相关组合在缓解视疲劳方面的实际作用，也没有证明各组分之间是否存在协同作用。引用文献2公开了一种抗蓝光眼部喷剂的组合物，其中包含桔皮干粉剂0.05?0.1%、叶黄素粉剂0.01?0.03%、维生素A0.05?0.1%、茶多酚粉剂0.1?0.2%、葡萄籽提取物粉剂0.05?0.1%、牛磺酸0.05?0.2%等。但其并没有验证和公布上述组合物在抵抗蓝光对眼睛伤害方面的具体效果，也没有证实各组分之间是否存在协同作用。[0006] 引用文献：[0007] 引用文献1：CN108771243A；[0008] 引用文献2：CN109549947A。发明内容[0009] 发明要解决的问题[0010] 虽然现有技术中已有针对例如缓解视疲劳或抗蓝光等有益于眼睛的组合物的研究，但这样的研究仍然不能说是完善的，对于缓解蓝光伤害的化学防护手段仍有待开发的空间。[0011] 本发明的目的在于提供一种使用了OPO和牛磺酸的缓解蓝光伤害的组合物，通过采用斑马鱼蓝光伤害模型，本发明验证了OPO和牛磺酸二者分别及其组合物在缓解蓝光伤害方面的作用，并且意外发现二者按一定比例进行组合时，能获得单独使用时无法达到的效果，即本发明发现OPO和牛磺酸二者在缓解蓝光伤害方面具有协同增效作用。[0012] 用于解决问题的方案[0013] 为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：[0014] 本发明第一方面提供了一种组合物，其中，所述组合物包含如下必要组分：[0015] 1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯和牛磺酸；[0016] 并且，在所述组合物中，所述1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯与所述牛磺酸的质量比为500:(0.38 42.25)。~[0017] 在一些实施方案中，在所述组合物中，所述1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯与所述牛磺酸的质量比为500:(13.42 42.2)。~[0018] 本发明第二方面提供了本发明第一方面所述的组合物在制备有助于缓解蓝光伤害的食品中的用途。[0019] 在一些实施方案中，所述有助于缓解蓝光伤害包括减少眼部细胞凋亡、降低眼部活性氧自由基积累、减少眼部脂质氧化产物含量、提高眼部抗氧化酶活力、降低基因il?1β表达量和改善眼部组织结构中的至少一种。[0020] 在一些实施方案中，所述脂质氧化产物包括丙二醛。[0021] 在一些实施方案中，所述抗氧化酶包括过氧化氢酶。[0022] 在一些实施方案中，所述改善眼部组织结构包括使眼睛尺寸恢复、使视网膜呈层级结构排列有序、使色素上皮层变厚且不出现色素弥散、使视锥和视杆细胞层细胞排列规则和使外核层和内核层细胞排列规则中的至少一种。[0023] 在一些实施方案中，所述食品为固态乳制品或液态乳制品。[0024] 在一些实施方案中，所述食品为婴幼儿食品或儿童食品。[0025] 在一些实施方案中，所述食品中还含有如下成分中的任意一种或多种：植物制品成分、动物乳制品成分、动物肉制品成分、功能性添加成分和任意的可接受的辅料。[0026] 发明的效果[0027] 通过上述技术方案的实施，本发明获得了以下技术效果：[0028] 本发明通过大量研究，开发了一种组合物，其包含特定比例的OPO和牛磺酸。相比单独的OPO或牛磺酸，本发明提供的组合物可以更加有效的缓解蓝光伤害；尤其的，可以有效清除由蓝光照射产生的活性氧自由基，减少眼部脂质氧化产物如MDA的含量，增加抗氧化酶如CAT的活力，减少促炎因子IL?1β基因il?1β的相对表达量，抑制炎症的发生，并且改善眼部受损组织的结构和状态。附图说明[0029] 图1：实施例1中样品处理后斑马鱼眼部凋亡细胞荧光强度；其中，与模型对照组比较， ， 。[0030] 图2：实施例1中样品处理后斑马鱼眼部凋亡细胞荧光强度典型图；其中，箭头所指的荧光颗粒为凋亡细胞。[0031] 图3：实施例1中样品处理后斑马鱼眼部凋亡细胞荧光强度；其中，与模型对照组比#较， ， ；与OPO250μg/mL比较，p<0.05；与牛磺酸0.403μg/mL比□ & ▲较，p<0.05；与牛磺酸1.34μg/mL比较，p<0.05；与牛磺酸6.71μg/mL比较，p○<0.05；与牛磺酸20.1μg/mL比较，p<0.05。[0032] 图4：实施例1中样品处理后斑马鱼眼部凋亡细胞荧光强度典型图；其中，箭头所指的荧光颗粒为凋亡细胞。[0033] 图5：实施例2中样品处理后斑马鱼头部荧光强度平均值；其中，与模型对照组比#较， ， ， ；与OPO250μg/mL浓度比较，p<0.05；与牛磺酸∞20.1μg/mL浓度比较，p<0.01。[0034] 图6：实施例2中样品处理后斑马鱼头部荧光强度平均值典型图；其中，虚线框内为斑马鱼头部分析区域。[0035] 图7：实施例3中样品处理后斑马鱼MDA含量；其中，与模型对照组比较， ，○；与牛磺酸20.1μg/mL浓度比较，p<0.05。[0036] 图8：实施例3中样品处理后斑马鱼CAT活力；其中，与模型对照组比较， ，○， ；与牛磺酸20.1μg/mL浓度比较，p<0.05。[0037] 图9：实施例4中样品处理后斑马鱼il?1β基因相对表达量；其中，与模型对照组比较， 。[0038] 图10：实施例4中样品处理后斑马鱼tnf?α基因相对表达量；其中，与模型对照组比较， 。[0039] 图11：实施例5中斑马鱼眼部组织分析区域及眼部视网膜横截面切片示例图；其中，黑色单边方括弧为斑马鱼眼部视网膜。[0040] 图12：实施例5中样品处理后斑马鱼眼部组织结构典型图；其中，①为白色十字双箭头线条，表示眼睛前后轴（A/P）与背腹轴（D/V）尺寸之和；②为黑色半边方括。硎臼油そ峁梗虎畚谏，表示色素上皮层；④为白色虚线椭圆区域，表示视锥和视杆细胞层；⑤为黑色虚线类扇形区域，表示外核层和内核层。具体实施方式[0041] 以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。本发明不限于以下说明的各构成，在本发明请求保护的范围内可以进行各种变更，而适当组合不同实施方式、实施例中各自公开的技术手段而得到的实施方式、实施例也包含在本发明的技术范围中。[0042] I.术语定义[0043] 在本发明中，使用“数值A 数值B”、“数值A?数值B”、“数值A以上”或数值A以下表示~的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。[0044] 在本发明中，术语“包含”、“包括”或“含有”可以指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的组分或方法步骤。与此同时，“包含”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的组分或方法步骤。[0045] 在本发明中，术语“约”用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体的相关数值。除非另有明确的说明，应当理解本发明所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在某一特定数值或范围的±3%、±2%、±1%或±0.5%之内。[0046] 在本发明中，术语“常温”或“室温”表示“23±2℃”的室内环境温度。[0047] 在本发明中，所使用“婴儿”表示0 6月龄的人类群组。~[0048] 在本发明中，所使用“较大婴儿”表示6 12月龄的人类群组。~[0049] 在本发明中，所使用“幼儿”表示12 36月龄的人类群组。~[0050] 在本发明中，所使用“婴幼儿”表示年龄3岁以下的人类群组。[0051] 在本发明中，所使用的“儿童”表示年龄大于3岁，且小于12岁，处于生长发育期的人类生活群体。[0052] 在本发明中，所述“婴幼儿配方食品”涵盖婴儿配方食品、较大婴儿配方食品和幼儿配方食品。通常，婴儿配方食品从婴儿出生起作为母乳替代品，较大婴儿配方食品是从婴儿出生后的6?12个月作为母乳替代品，幼儿配方食品指从婴儿出生后的12?36个月作为母乳替代品。[0053] 在本发明中，使用“动物乳”表示从处于泌乳期间的哺乳动物的乳腺获得的液体。术语“动物乳”应被广义地解释，并且涵盖生乳（即，直接从乳腺获得的液体）和标准化乳制品（例如像脱脂乳或全脂乳）两者。[0054] 除非另有定义，本发明所用的其他技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。[0055] II.组合物[0056] 本发明提供了一种组合物，其包含如下必要组分：1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯和牛磺酸；并且，在所述组合物中，所述1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯与所述牛磺酸的质量比为500:(0.38 42.25)。~[0057] 相比单独的1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯或牛磺酸，本发明提供的组合物可以更加有效的缓解蓝光对眼部造成的伤害。在缓解蓝光伤害方面，1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯和牛磺酸之间具有协同增效的作用，特别是当其二者的含量比例处于上述范围内时，相关效果尤为突出。[0058] 示例性的，在所述组合物中，所述1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯与所述牛磺酸的质量比可以为约500:0.4、500:0.5、500:1、500:2、500:3、500:4、500:5、500:6、500:7、500:8、500:9、500:10、500:11、500:12、500:13、500:14、500:15、500:16、500:17、500:18、500:19、500:20、500:21、500:22、500:23、500:24、500:25、500:26、500:27、500:28、500:29、500:30、500:31、500:32、500:33、500:34、500:35、500:36、500:37、500:38、500:39、500:40、500:41或500:42等。[0059] 为了获得更优的协同增效的缓解蓝光伤害的作用，在一些实施方案中，在所述组合物中，所述1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯与所述牛磺酸的质量比为500:(0.403 42.2)；优~选为500:(6.71 42.2)；更优选为500:(13.42 42.2)；甚至更优选为500:(20.1 42.2)；进~ ~ ~一步更优选为500:(38.2 42.2)。~[0060] 在一些实施方案中，所述组合物由1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯和牛磺酸组成，并且，在所述组合物中，所述1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯与所述牛磺酸的质量比为500:(0.38 42.25)。~[0061] 本发明对于所述组合物的形态不做特别限定，典型的，可以为液体或固体等。[0062] 在一些实施方案中，在本发明所述的组合物中，1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯的含量大于等于200?g/mL，优选大于等于250?g/mL，更优选为250 500?g/mL；牛磺酸的含量~大于等于0.1?g/mL，优选大于等于0.403?g/mL，更优选大于等于6.71?g/mL，甚至更优选为6.71 20.1?g/mL。~[0063] 本发明所述的组合物通常是人工合成或复配的组合物，即并非是天然的例如母乳等组合物。[0064] III.缓解蓝光伤害的用途[0065] 本发明提出将1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯与牛磺酸以特定比例复配，可以缓解蓝光对于眼部的伤害，且两种物质之间具有协同增效的作用。因此，本发明提供了上述组合物在制备有助于缓解蓝光伤害的食品中的用途，并且，本发明所述的缓解蓝光伤害不以治疗或预防疾病为目的，所述蓝光伤害也未达到疾病的程度。[0066] 在一些实施方案中，所述有助于缓解蓝光伤害包括减少眼部细胞凋亡、降低眼部活性氧自由基积累、减少眼部脂质氧化产物含量、提高眼部抗氧化酶活力、降低基因il?1β表达量和改善眼部组织结构中的至少一种。[0067] 本发明通过试验发现，1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯和牛磺酸的组合物能够有效清除蓝光照射斑马鱼眼部所产生的活性氧自由基，减少眼部脂质氧化产物的含量，增加抗氧化酶的活力，减少促炎因子IL?1β基因il?1β的相对表达量，抑制炎症的发生，并且改善眼部受损组织的结构和状态。且组合物中的两种成分在上述效果方面具有协同增效的作用。[0068] 在一些实施方案中，所述脂质氧化产物包括丙二醛（MDA）。[0069] 在一些实施方案中，所述抗氧化酶包括过氧化氢酶（CAT）。[0070] 在一些实施方案中，所述改善眼部组织结构包括使眼睛尺寸恢复、使视网膜呈层级结构排列有序、使色素上皮层变厚且不出现色素弥散、使视锥和视杆细胞层细胞排列规则和使外核层和内核层细胞排列规则中的至少一种。[0071] 对于具体的可用上述组合物制备的具有缓解蓝光伤害作用的食品，本发明不做特别限定。在一些实施方案中，所述食品为固态乳制品或液态乳制品；例如奶粉、奶酪、酸奶、液态奶等。在一些实施方案中，所述食品为婴幼儿食品或儿童食品；例如婴幼儿配方奶粉、儿童配方奶粉、水解配方奶粉、儿童零食等。[0072] 在一些实施方案中，在所述食品中，所述1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯与所述牛磺酸的质量比为500:(0.38 42.25)；优选为500:(0.403 42.2)；更优选为500:(6.71 42.2)；~ ~ ~进一步优选为500:(13.42 42.2)；甚至更优选为500:(20.1 42.2)；进一步更优选为500:~ ~(38.2 42.2)。~[0073] 在食品中，1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯和牛磺酸的具体含量没有特别限定，满足食品相关法律法规的要求即可。在一些实施方案中，在所述食品中，1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯的含量大于等于3500?g/mL，优选大于等于5500?g/mL，更优选为5500 7800?g/~mL；牛磺酸的含量大于等于25?g/mL，优选大于等于35?g/mL，更优选大于等于49?g/mL，甚至更优选为49 60?g/mL。~[0074] 根据食品的种类和适用对象的最终需求，在一些实施方案中，所述食品中还含有如下成分中的任意一种或多种：植物制品成分、动物乳制品成分、动物肉制品成分、功能性添加成分和任意的可接受的辅料。[0075] 对于植物制品成分，可以例举的包括无花果、石榴、猕猴桃、橘子、橙子、菠萝、草莓、苹果、香蕉、葡萄、梨、樱桃、蓝莓、黑莓、黑加仑、蔓越莓、覆盆莓、甜瓜、余甘子和山桑子等水果或它们的提取物；洋蔥、黄瓜、番茄、花椰菜、红萝卜、菠菜、芥蓝、球芽甘蓝、大蒜、罗勒、奧勒冈草等果蔬类物质或它们的提取物；稻类（籼稻、粳稻、糯稻）、麦类（小麦、大麦、燕麦、黑麦）、玉米、高粱、粟、黍、黄米、荞麦、大豆、蚕豆、豌豆、绿豆、红小豆、芸豆等谷物或它们的提取物；核桃、开心果、腰果、榛子、扁桃、杏仁、松子、花生、瓜子、板栗、夏威夷果、白果等坚果类物质或它们的提取物；咖啡或其提取物；以及一些药食同源的植物性中药材或其提取物。[0076] 对于动物乳制品成分，可以例举的包括来源于牛、羊等的鲜乳，以及全脂乳粉、脱脂乳粉、浓缩乳清蛋白粉、脱盐乳清粉、乳清蛋白粉、水解乳清蛋白粉等再加工乳制品。[0077] 对于动物肉制品成分，可以例举的包括猪、牛、羊、水产类或禽类的肉制品成分。[0078] 对于功能性添加成分，可以例举的包括维生素补充剂、矿物质补充剂、核苷酸补充剂、膳食纤维等。[0079] 对于任意的可接受的辅料，可以例举的包括溶剂、抗氧剂、抗菌剂、增稠剂、稀释剂、助溶剂、稳定剂、乳化剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣材料、抗结块剂、矫味剂、甜味剂、食用香精、食用色素等。[0080] 实施例[0081] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用材料或仪器除非特别说明，均为可以使用通过市购获得的常规产品。[0082] 实施例1：抗眼凋亡功效评价[0083] 1.试验材料[0084] 1.1.样品配制信息[0085] 1,3?二油酸?2?棕榈酸甘油酯（OPO），购买自邦吉洛德斯，溶剂为DMSO。[0086] 牛磺酸，购买自帝斯曼，溶剂为标准稀释水。[0087] 阳性对照：叶黄素，购买自帝斯曼，溶剂为DMSO。[0088] 1.2.实验动物[0089] 斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450~550μS/cm；pH为6.5~8.5；硬度为50~100mg/LCaCO3），由杭州环特生物养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2022?0004，饲养管理符合国际AAALAC认证（认证编号：001458）的要求，IACUC伦理审查号：IACUC?2023?6809?01。[0090] 进行实验时，给予斑马鱼OPO单体的方式为：先利用DMSO溶解OPO作为母液，随后利用DMSO与水的互溶性将母液用标准稀释水稀释至目标浓度，并将斑马鱼饲养于目标浓度的样品溶液中；给予斑马鱼牛磺酸单体的方式为：使用标准稀释水溶解牛磺酸至目标浓度，并将斑马鱼饲养于目标浓度的样品溶液中；给予斑马鱼叶黄素单体的方式与给予斑马鱼OPO单体的方式相同；给予斑马鱼OPO和牛磺酸组合物的方式为：先利用DMSO溶解OPO作为母液，随后利用DMSO与水的互溶性，利用标准稀释水稀释OPO母液的同时溶解牛磺酸，直至目标浓度，并将斑马鱼饲养于目标浓度的样品溶液中。[0091] 1.3.仪器、耗材与试剂[0092] 解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS，Japan）；CCD相机（VertA1，上海土森视觉开云优惠体育网页版入口有限公司，China）；精密电子天平（CP214，OHAUS，USA）；6孔板（浙江贝兰伯生物技术有限公司，China）；电动聚焦连续变倍荧光显微镜（AZ100，Nikon，Japan）；超声波清洗机（JP?010T，深圳市洁盟清洗设备有限公司，China）；全自动样品快速研磨仪（JXFSTPRP?24L，上海净信实验设备开云优惠体育网页版入口部，China）；蓝光仪（50w450nm，China）。[0093] 二甲基亚砜（DMSO，Sigma，Switzerland；I2229063，上海阿拉丁生化开云优惠体育网页版入口股份有限公司，China）；链酶蛋白酶E（上海源叶生物开云优惠体育网页版入口有限公司，China）；吖啶橙（AO，上海麦克林生化开云优惠体育网页版入口有限公司，China）；甲基纤维素（上海阿拉丁生化开云优惠体育网页版入口股份有限公司，China）。[0094] 2.试验方法[0095] 2.1.最大检测浓度（MTC）测定[0096] 随机选取受精后1天（1dpf）野生型AB品系斑马鱼破膜后进行蓝光照射，建立斑马鱼蓝光眼损伤模型。3dpf时挑选发育状态良好的模型斑马鱼随机分配于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予样品（浓度见表1?1），同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。28℃处理1天后，测定样品对模型斑马鱼的MTC。[0097] 2.2.抗眼凋亡功效评价[0098] 2.2.1单体成分抗眼凋亡功效评价[0099] 随机选取1dpf野生型AB品系斑马鱼破膜后进行蓝光照射，建立斑马鱼蓝光眼损伤模型。3dpf时挑选发育状态良好的模型斑马鱼随机分配于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予不同浓度样品（见表1?2）：125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml和2000μg/ml，设置阳性对照叶黄素浓度为1000μg/mL，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。28℃处理1天后，各实验组斑马鱼进行AO避光染色30min，标准稀释水清洗3遍后，每个实验组随机选择10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用ImageJ软件分析并采集数据，分析统计斑马鱼眼部凋亡细胞荧光强度，以上述指标的统计学分析结果评价样品的抗眼凋亡功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。[0100] 2.2.2组合物抗眼凋亡功效评价[0101] 根据上述抗眼凋亡功效评价结果，优选OPO和牛磺酸浓度进行组合试验，评价组合物的相关效果，试验条件与上述评价方法相同，设置阳性对照叶黄素浓度为1000μg/mL，同时设置正常对照组和模型对照组。试验结束后斑马鱼处理、数据采集以及分析方法与上述相同。[0102] 3.试验结果[0103] 3.1.MTC[0104] 详见表1?1。试验结果表明，阳性对照叶黄素、OPO以及牛磺酸对模型斑马鱼的MTC均为2000μg/mL。[0105] 表1?1.样品抗眼凋亡功效浓度摸索实验结果（n=30）[0106][0107] 3.2．抗眼凋亡功效评价[0108] 3.2.1单体成分抗眼凋亡功效评价[0109] 试验结果表明，1dpf野生型AB品系斑马鱼破膜后进行蓝光照射后，其眼部凋亡细胞的荧光强度显著上升（表1?2、图1），且与正常对照组相比p＜0.001，这说明蓝光照射导致斑马鱼眼部细胞的凋亡显著增加，即建模成功。而阳性对照叶黄素、单体成分OPO以及牛磺酸在一定浓度下均表现出抗眼凋亡功效（与模型对照组眼部凋亡细胞荧光强度相比，p＜0.01或0.001），具体浓度为叶黄素1000μg/mL，OPO500μg/mL、1000μg/mL以及2000μg/mL以及牛磺酸1000μg/mL和2000μg/mL（详见表1?2）。而从斑马鱼眼部凋亡细胞荧光强度典型图（图2）也可以发现，经上述成分特定浓度处理后的眼凋亡细胞荧光强度与模型对照组相比，荧光的强度/斑点大小有减弱/变小的趋势，且单体成分浓度越高，上述效果就越明显。[0110] 表1?2.单体成分抗眼凋亡功效评价实验结果（n=10）[0111][0112] 3.2.2组合物抗眼凋亡功效评价[0113] 根据上述单体成分抗眼凋亡功效评价结果，我们分别优选了OPO和牛磺酸不同浓度进行组合（具体组合浓度见表1?3），再次对其抗眼凋亡功效进行评价，结果见表1?3和图3。在本次试验条件下，我们发现，OPO单体浓度500?g/mL时依然能有效降低斑马鱼眼细胞的荧光强度，而牛磺酸由于所选浓度远低于单体试验时的起作用浓度（1000?g/mL），因此并未能显著降低眼部凋亡细胞荧光强度，因此也不具有防蓝光损伤的功效。而组合后的OPO和牛磺酸（二者比例为500:（0.403 40.2））则都表现出了显著的抗斑马鱼眼凋亡功效（与模~型对照组相比，p＜0.01或0.001）。且组合物作用下斑马鱼眼凋亡细胞荧光强度低于二者同浓度单独使用时的细胞荧光强度的平均值，OPO和牛磺酸二者具有协同增效作用。当OPO和牛磺酸二者比例为500:（0.403 40.2）时，斑马鱼眼部细胞凋亡荧光强度均降到了很低的水~平（如图3所示），与阳性对照叶黄素相当。荧光强度典型图中所展示的荧光点的大小和/或强度均有变小和/或减弱的趋势（如图4所示），这说明上述组合具有很好的抗蓝光引起的眼部细胞凋亡的作用。特别地，当二者组合浓度为250+20.1?g/mL时，组合物具有非常明显的抗眼部细胞凋亡的效果，其效果好于OPO浓度250?g/mL以及牛磺酸浓度20.1?g/mL分别单独使用时的效果（p＜0.05），且该组合物的效果显著好于二者单独使用时的平均效果（p＜0.05），可以认为二者在该比例下（500:40.2）的协同增效作用最显著。[0114] 表1?3.组合物抗眼凋亡功效评价实验结果（n=10）[0115][0116] 实施例2：ROS清除效果评价[0117] 1.检测材料[0118] 1.1.样品配制信息[0119] OPO的溶剂为DMSO，牛磺酸的溶剂为标准稀释水，阳性对照叶黄素的溶剂也为DMSO。[0120] 1.2.实验动物[0121] 斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450~550μS/cm；pH为6.5~8.5；硬度为50~100mg/LCaCO3），由杭州环特生物养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2022?0004，饲养管理符合国际AAALAC认证（认证编号：001458）的要求，IACUC伦理审查号：IACUC?2023?6809?01。[0122] 进行实验时，给予斑马鱼不同样品的方式同实施例1所述。[0123] 1.3.仪器、耗材与试剂[0124] 解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS，Japan）；CCD相机（VertA1，上海土森视觉开云优惠体育网页版入口有限公司，China）；精密电子天平（CP214，OHAUS，USA）；6孔板（浙江贝兰伯生物技术有限公司，China）；电动聚焦连续变倍荧光显微镜（AZ100，Nikon，Japan）；超声波清洗机（JP?010T，深圳市洁盟清洗设备有限公司，China）；蓝光仪（50w450nm，China）。[0125] 二甲基亚砜（DMSO，上海阿拉丁生化开云优惠体育网页版入口股份有限公司，China）；链酶蛋白酶E（上海源叶生物开云优惠体育网页版入口有限公司，China）；CellROXGreenReagent（Invitrogen，USA）；甲基纤维素（上海阿拉丁生化开云优惠体育网页版入口股份有限公司，China）。[0126] 2.检测方法[0127] 随机选取1dpf黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼破膜后进行蓝光照射，建立斑马鱼蓝光眼损伤模型。3dpf时挑选发育状态良好的模型斑马鱼随机分配于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予样品和阳性对照叶黄素（浓度见表2?1），同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。28℃处理1天后，各实验组斑马鱼进行CellROX避光染色30min，标准稀释水清洗3遍后，每个实验组随机选择10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用NIS?ElementsD3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析统计斑马鱼头部荧光强度平均值，以该指标的统计学分析结果评价样品对ROS水平的影响。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。[0128] 3.检测结果[0129] 蓝光照射导致眼部细胞中的活性氧自由基（ROS）积累，造成对细胞的氧化损伤。试验结果显示，经蓝光照射后，模型对照组中ROS荧光强度显著高于正常对照组（p＜0.001），说明蓝光照射使得斑马鱼眼部的ROS的非正常积累，建模成功。与模型对照组比较，阳性对照叶黄素（1000μg/mL）、OPO（250μg/mL）、牛磺酸（20.1μg/mL）以及OPO+牛磺酸组合物（250+20.1μg/mL）均具有ROS清除功效，具体表现为降低斑马鱼头部荧光强度平均值（表2?1、图5），而斑马鱼头部的荧光水平相比模型对照组也有所降低（图6）；其中，阳性对照叶黄素（1000μg/mL）、OPO（250μg/mL）以及OPO+牛磺酸组合物（250+20.1μg/mL）对于ROS的清除作用与模型对照组相比更是达到了显著水平（p＜0.05或p＜0.01）。与单体成分OPO和牛磺酸相比，组合物（OPO250μg/mL+牛磺酸20.1μg/mL，即二者比例为500:40.2）清除由蓝光照射所产生的ROS的效果更佳（与OPO250μg/mL浓度比较，p<0.05；与牛磺酸20.1μg/mL浓度比较，p<0.01），且组合物效果显著优于与组合物同浓度时两个单体效果的平均值（p<0.01），OPO和牛磺酸在该比例时使用具有协同增效的作用，能增强单体清除由蓝光照射所产生的ROS的效果。[0130] 表2?1.样品ROS清除效果评价试验结果（n=10）[0131][0132] 实施例3：对氧化损伤相关酶含量/活力的影响评价[0133] 1.检测材料[0134] 1.1样品配置信息[0135] OPO的溶剂为DMSO，牛磺酸的溶剂为标准稀释水。[0136] 1.2试验动物[0137] 斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450~550μS/cm；pH为6.5~8.5；硬度为50~100mg/LCaCO3），由杭州环特生物养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2022?0004，饲养管理符合国际AAALAC认证（认证编号：001458）的要求，IACUC伦理审查号：IACUC?2023?6809?01。[0138] 进行实验时，给予斑马鱼不同样品的方式同实施例1所述。[0139] 1.3仪器、耗材与试剂[0140] 解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS，Japan）；CCD相机（VertA1，上海土森视觉开云优惠体育网页版入口有限公司，China）；精密电子天平（CP214，OHAUS，USA）；6孔板（浙江贝兰伯生物技术有限公司，China）；超声波清洗机（JP?010T，深圳市洁盟清洗设备有限公司，China）；蓝光仪（50w450nm，China）；96孔板（NestBiotech，China）；全自动样品快速研磨仪（JXFSTPRP?24L，上海净信实验设备开云优惠体育网页版入口部，China）；高速冷冻离心机（Heraeus Fresco17，ThermoFisher，Germany）；多功能酶标仪（SPARK，TECAN，Austria）；电子恒温不锈钢水浴锅（HHS?2S，上海康路仪器设备有限公司，China）。[0141] 二甲基亚砜（DMSO，上海阿拉丁生化开云优惠体育网页版入口股份有限公司，China）；链酶蛋白酶E（上海源叶生物开云优惠体育网页版入口有限公司，China）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（博士德生物，China）；氯化钠注射液（湖南科伦制药有限公司，China）；PBS磷酸盐缓冲液（Biosharp，China）；冰乙酸（上海阿拉丁生化开云优惠体育网页版入口股份有限公司，China）；丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，China）；过氧化氢（CAT）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，China）。[0142] 2.检测方法[0143] 2.1对丙二醛（MDA）含量的影响[0144] 随机选取1dpf野生型AB品系斑马鱼破膜后进行蓝光照射，建立斑马鱼蓝光眼损伤模型。3dpf时挑选发育状态良好的模型斑马鱼随机分配于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予样品（浓度见表3?1），同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL，平行设置3次生物学重复。28℃处理1天后，按照MDA试剂盒说明书收集斑马鱼样本，利用多功能酶标仪进行MDA含量检测，分析斑马鱼体内MDA含量，以该指标的统计学分析结果评价样品对MDA含量的影响。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。[0145] 2.2对过氧化氢酶（CAT）活力的影响[0146] 随机选取1dpf野生型AB品系斑马鱼破膜后进行蓝光照射，建立斑马鱼蓝光眼损伤模型。3dpf时挑选发育状态良好的模型斑马鱼随机分配于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予样品（浓度见表3?2），同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL，平行设置3次生物学重复。28℃处理1天后，按照CAT试剂盒说明书收集斑马鱼样本，利用多功能酶标仪进行CAT活力检测，分析斑马鱼体内CAT活力，以该指标的统计学分析结果评价样品对CAT活力的影响。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。[0147] 3.检测结果[0148] 3.1对MDA含量的影响[0149] 蓝光照射导致眼部氧化损伤，其中就包括对细胞脂质的氧化，而丙二醛（MDA）是脂类氧化产物之一，能够衡量氧化损伤的严重程度。试验结果表明，经蓝光照射后，模型对照组中的MDA含量较正常细胞显著增加（p<0.001），说明蓝光照射对眼部细胞脂质造成了明显的氧化损伤，脂质氧化导致MDA的含量显著增加。与模型对照组比较，单体OPO（250μg/mL）、单体牛磺酸（20.1μg/mL）以及OPO与牛磺酸组合（250+20.1μg/mL）均使得模型斑马鱼眼部的MDA含量减少（如表3?1，图7所示），而其中单体OPO（250μg/mL）和OPO与牛磺酸组合（250+20.1μg/mL）降低MDA的效果更为显著（与模型对照组相比，p<0.01）。OPO与牛磺酸组合（250+20.1μg/mL）处理的MDA含量最低，且低于二者同浓度单独使用时效果的平均值（1.80<1.94），OPO与牛磺酸在该比例下有协同增效的效果，能够获得比同浓度单体单独使用时获得更优的效果。[0150] 表3?1.样品对丙二醛（MDA）含量的影响评价实验结果（n=3）[0151][0152] 3.2对CAT活力的影响[0153] 过氧化氢酶（CAT）是一种生物体内广泛存在的抗氧化酶。它能够催化过氧化氢分解为水和氧气，从而保护细胞免受过氧化氢的氧化损伤。试验结果显示（如表3?2和图8所示），模型对照组中CAT活力较正常对照组显著降低，说明造模成功。与模型对照组比较，单体OPO（250μg/mL）、单体牛磺酸（20.1μg/mL）以及OPO和牛磺酸的组合物（250+20.1μg/mL）均提高了斑马鱼眼部细胞中的CAT活力，说明三者可以对蓝光损害起到一定的保护作用。其中，单体OPO（250μg/mL）以及OPO和牛磺酸的组合物（250+20.1μg/mL）提高CAT活力的效果更为显著（与模型对照组相比，p<0.05或p<0.01）。同时，数据显示组合物（OPO和牛磺酸，浓度为250μg/mL和20.1μg/mL）作用条件下斑马鱼眼部细胞中的CAT活力高于同浓度条件下单体作用效果的平均值（表3?2，0.574＞0.456），OPO和牛磺酸在该比例下具有协同增效的作用，即组合物使用时可以产生大于同浓度单体分别使用时的效果。[0154] 表3?2.样品对过氧化氢酶（CAT）活力的影响评价实验结果（n=3）[0155][0156] 实施例4：对炎症相关基因表达的影响评价[0157] 1.检测材料[0158] 1.1.样品配制信息[0159] OPO溶剂为DMSO，牛磺酸溶剂为标准稀释水。[0160] 1.2.实验动物[0161] 斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450~550μS/cm；pH为6.5~8.5；硬度为50~100mg/LCaCO3），由环特生物养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2022?0004，饲养管理符合国际AAALAC认证（认证编号：001458）的要求，IACUC伦理审查号：IACUC?2023?6809?01。[0162] 进行实验时，给予斑马鱼不同样品的方式同实施例1所述。[0163] 1.3.仪器、耗材与试剂[0164] 解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS，Japan）；CCD相机（VertA1，上海土森视觉开云优惠体育网页版入口有限公司，China）；精密电子天平（CP214，OHAUS，USA）；6孔板（浙江贝兰伯生物技术有限公司，China）；超声波清洗机（JP?010T，深圳市洁盟清洗设备有限公司，China）；全自动样品快速研磨仪（JXFSTPRP?24L，上海净信实验设备开云优惠体育网页版入口部，China）；蓝光仪（50w450nm，China）；高速冷冻离心机（HeraeusFresco17，ThermoFisher，Germany）；全自动核酸提取仪（Auto?Pure32A，杭州奥盛仪器有限公司，China）；普通PCR扩增仪（T100，BIO?RAD，Singapore）；荧光定量PCR仪（CFX Connect，BIO?RAD，Singapore）；紫外?可见光分光光度计（Nanodrop2000，Thermo，USA）；微孔板迷你离心机（BE?6100，海门市其林贝尔仪器制造有限公司，China）；光学粘性封膜B（MSB1001，Bio?rad，USA）；低位裙边96孔板（透明）（HSP9601，Bio?rad，USA）。[0165] 二甲基亚砜（DMSO，上海阿拉丁生化开云优惠体育网页版入口股份有限公司，China）；链酶蛋白酶E（上海源叶生物开云优惠体育网页版入口有限公司，China）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，China）；ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix（Vazyme，China）；FastKingcDNA第一链合成试剂盒（去基因组）（天根生化开云优惠体育网页版入口（北京）有限公司，China）；预装磁珠法通用型RNA提取试剂盒C（佛山奥维生物开云优惠体育网页版入口有限公司（ONREW），China）。[0166] 2.检测方法[0167] 随机选取1dpf野生型AB品系斑马鱼破膜后进行蓝光照射，建立斑马鱼蓝光眼损伤模型。3dpf时挑选发育状态良好的模型斑马鱼随机分配于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予一定浓度的样品（浓度见表4?3），同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL，平行设置3次生物学重复。28℃处理1天后，使用全自动核酸提取仪提取各组斑马鱼总RNA，利用紫外?可见光分光光度计对总RNA浓度和纯度进行测定。取2.00μg斑马鱼样品总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明操作，合成20.0μLcDNA，通过q?PCR检测β?actin、il?1β和tnf?α基因的表达。用β?actin作为基因表达的内参，计算il?1β和tnf?α基因的RNA相对表达量。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。[0168] 3.检测结果[0169] 3.1.RNA提取结果及引物序列信息[0170] 在实验终点，提取斑马鱼总RNA，用紫外?可见光分光光度计测定RNA的浓度及A260/A280比值（表4?1），A260/A280比值均在1.8?2.2之间，表明提取得到斑马鱼总RNA质量较好，可用于后续q?PCR实验。引物序列见表4?2。[0171] 表4?1.总RNA的浓度及A260/A280比值（n=3）[0172][0173] 表4?2.引物序列信息[0174][0175] 3.2.对炎症相关基因表达的影响[0176] 白介素1?β（IL?1β）是一种关键的促炎细胞因子，是炎症和宿主对感染反应最重要的介质之一，参与多种自身免疫性炎症反应和多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。IL?1β的过量产生与不同疾病状态下发生的病理生理学变化有关，炎症感染细胞中往往IL?1β产生增加。肿瘤坏死因子α（TNF?α）为炎症反应的强效诱导剂和先天免疫的关键调节器，是主要由巨噬细胞和单核细胞产生的一种促炎细胞因子，介导多种炎性疾。哂兄苯又虏∽饔煤陀盏疾渌仔砸蜃臃⒒幼橹苹底饔。[0177] 试验结果显示（表4?3，图9、10），经蓝光照射后，模型对照组中促炎因子il?1β和tnf?α基因的相对表达量均显著提高，说明蓝光照射使得斑马鱼眼部细胞出现明显的炎症反应。经单体OPO、单体牛磺酸以及OPO和牛磺酸的组合物作用后，il?1β基因相对表达量均有下调，其中，组合物的效果更为明显（其与模型对照组相比，p<0.05），即组合物可以显著改善由蓝光照射导致的斑马鱼眼部的炎症反应，且该效果同样显著优于同浓度下单体单独作用时效果的平均值（0.668<0.873，p=0.05），OPO与牛磺酸在该比例下具有协同增效的作用，即二者组合使用时能达到同浓度单体单独作用时无法达到的效果。对于tnf?α基因的相对表达量，单体OPO、单体牛磺酸以及OPO和牛磺酸的组合物均有使其提高的趋势，但该种效果并不明显。[0178] 表4?3.样品对炎症相关基因表达的影响评价实验结果（n=3）[0179][0180] 实施例5：对眼部组织病理学的影响评价[0181] 1.检测材料[0182] 1.1.样品配制信息[0183] 叶黄素和OPO，溶剂均为DMSO。牛磺酸溶剂为标准稀释水。[0184] 1.2.实验动物[0185] 斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450~550μS/cm；pH为6.5~8.5；硬度为50~100mg/LCaCO3），由环特生物养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2022?0004，饲养管理符合国际AAALAC认证（认证编号：001458）的要求，IACUC伦理审查号：IACUC?2023?6809?01。[0186] 进行实验时，给予斑马鱼不同样品的方式同实施例1所述。[0187] 1.3.仪器、耗材与试剂[0188] 解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS，Japan）；CCD相机（VertA1，上海土森视觉开云优惠体育网页版入口有限公司，China）；精密电子天平（CP214，OHAUS，USA）；6孔板（浙江贝兰伯生物技术有限公司，China）；超声波清洗机（JP?010T，深圳市洁盟清洗设备有限公司，China）；蓝光仪（50w450nm，China）；电子恒温不锈钢水浴锅（HHS?2S，上海康路仪器设备有限公司，China）；切片机（KD2258，金华科迪仪器设备有限公司，China）；智能型电热板（400X280，天津市莱悦纳格实验室仪器销售有限公司，China）；生物显微镜（CX31，OLYMPUS，Japan）。[0189] 二甲基亚砜（DMSO，上海阿拉丁生化开云优惠体育网页版入口股份有限公司，China）；链酶蛋白酶E（上海源叶生物开云优惠体育网页版入口有限公司，China）；4%组织细胞固定液（北京索莱宝开云优惠体育网页版入口有限公司，China）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，China）；二甲苯（国药集团化学试剂有限公司，China）；Mayer苏木素染色液（上海依赫生物开云优惠体育网页版入口有限公司，China）；伊红染色液（上海依赫生物开云优惠体育网页版入口有限公司，China）；盐酸（西陇化工有限公司，China）；中性树胶（北京索莱宝开云优惠体育网页版入口有限公司，China）；高效切片石蜡（熔点54?56℃，上海华永石蜡有限公司，China）；高效切片石蜡（熔点62?64℃，上海华永石蜡有限公司，China）。[0190] 2.检测方法[0191] 随机选取1dpf野生型AB品系斑马鱼破膜后进行蓝光照射，建立斑马鱼蓝光眼损伤模型。3dpf时挑选发育状态良好的模型斑马鱼随机分配于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予样品（浓度见图12），同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。28℃处理1天后，用4%组织细胞固定液将斑马鱼固定，经系列脱水?包埋?切片?染色等步骤，对斑马鱼进行组织病理学H&E染色分析。通过眼部组织病理分析，评价样品对斑马鱼眼部组织病理学的影响。[0192] 3.检测结果[0193] 图11展示了斑马鱼眼部组织分析区域切片以及各组织名称。试验结果显示（图12），正常对照组斑马鱼眼部组织大小形态正常，视网膜结构清晰完整，各层级细胞均排列整齐有序。与正常对照组相比，经蓝光照射后的模型对照组斑马鱼眼睛尺寸有所缩。ㄈ缤12中①所示），视网膜结构紊乱、不呈层级结构、无序排列（如图12中②所示），最外保护层色素上皮层厚度变薄且出现色素弥散现象，由黑色弥散变浅呈黑褐色（如图12中③所示），光感受器视锥和视杆细胞层细胞排列不规则（如图12中④所示），起结构支撑作用的外核层和内核层细胞排列不规则（如图12中⑤所示），上述种种迹象表明，斑马鱼蓝光眼损伤模型建立成功。[0194] 与模型对照组相比，叶黄素1000μg/mL浓度下斑马鱼眼睛尺寸明显恢复，视网膜呈层级结构排列且排列有序，色素上皮层厚度明显变厚且未出现色素弥散，视锥和视杆细胞层细胞排列规则，外核层和内核层细胞排列有所恢复。OPO和牛磺酸组合（250+20.1μg/mL）浓度下斑马鱼眼睛尺寸也明显恢复，视网膜呈层级结构排列有序，色素上皮层厚度明显变厚且未出现色素弥散，视锥和视杆细胞层细胞排列规则，外核层和内核层细胞排列规则，眼部组织形态与正常对照组斑马鱼相近。由此可以判断，经叶黄素（1000μg/mL）以及OPO和牛磺酸组合（250+20.1μg/mL）作用后，经蓝光照射的斑马鱼眼部的组织结构有所恢复，它们对于蓝光照射所造成的斑马鱼眼部组织损伤有缓解和改善的作用。[0195] 综上所述，蓝光具有较高能量，一定程度的蓝光照射会造成斑马鱼眼部出现氧化损伤，具体表现为眼部活性氧自由基（ROS）的非正常积累，眼部相关抗氧化酶活力（如过氧化氢酶，CAT）的降低，进而导致眼部脂质氧化的增加，而脂质氧化相关产物如丙二醛（MDA）就会相应增加。氧化损伤导致眼部促炎因子如IL?1β和TNF?α的基因il?1β、tnf?α相对表达量的上调，诱发炎症反应，最终出现斑马鱼眼部细胞的凋亡甚至组织结构的异常改变。本试验发现，一定浓度的单体OPO、单体牛磺酸以及一定比例的OPO和牛磺酸的组合物能够缓解由蓝光照射所造成的损害，具体表现为减少眼部细胞凋亡的程度，清除眼部活性氧自由基，减少脂质氧化产物（MDA）的含量，增加抗氧化酶（CAT）的活力，减少促炎因子IL?1β基因il?1β的相对表达量，抑制炎症的发生，并且改善眼部受损组织的结构和状态。经比较发现，一定比例的OPO+牛磺酸组合物（500:0.403 40.2），均可一定程度减少因蓝光照射所导致的眼部~细胞凋亡。且组合物的效果优于同浓度单体单独使用时的平均效果，也就意味着这些组合物存在协同增效的作用，组合使用时能达到单体单独使用时不能达到的效果。尤其的，当二者组合浓度为250+20.1?g/mL（二者比例为500:40.2）时，虽然其总浓度（270.1?g/mL）低于二者浓度为500+0.403、500+1.34、500+6.71?g/mL（二者比例为500:（0.403 6.71））等时的~总浓度，但该组合物具有非常明显的抗眼部细胞凋亡的效果，且其效果好于OPO浓度250?g/mL以及牛磺酸浓度20.1?g/mL分别单独使用时的效果（p＜0.05），也显著优于二者单独使用时的平均效果（p＜0.05），因此可以认为二者在该比例下（500:40.2）的效果最佳，且协同增效作用最为显著。后续以该组合为例，进一步证实OPO和牛磺酸的组合物能够有效清除蓝光照射斑马鱼眼部所产生的活性氧自由基，减少眼部脂质氧化产物（MDA）的含量，增加抗氧化酶（CAT）的活力，减少促炎因子IL?1β基因il?1β的相对表达量，抑制炎症的发生，并且改善眼部受损组织的结构和状态。且组合物的上述效果均优于同浓度下单体成分单独使用时的平均效果，因而具有协同增效的作用。[0196] 产业上的可利用性[0197] 本发明提供的组合物可以在工业中规模化生产和使用。

专利地区：吉林

专利申请日期：2024-07-08

专利公开日期：2024-10-01

专利公告号：2024-10-01