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专利名称：角豆树果荚中二氢杨梅素-3-O-没食子酸的提取方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310353512.5

专利申请（专利权）人：融致丰生制药有限公司
权利人地址：吉林省通化市梅河口市建国路4455号

专利发明（设计）人：吴成,李泽恩,李太娟,全小红,迪丽胡玛尔·热哈玛提

专利摘要：本发明提供角豆树果荚中二氢杨梅素?3?O?没食子酸的提取方法，包括将干燥的角豆树去种子的果荚粉碎，然后经不同浓度的乙醇溶液回流提取数次后，合并提取液浓缩成浸膏，然后用纯化水稀释分散，经大孔吸附树脂D101吸附后，用蒸馏水、乙醇溶液洗脱后，回收溶剂中的非糖小分子。然后用甲醇分散小分子，经石油醚、乙酸乙酯分别萃取数次，回收的得到乙酸乙酯部位，乙酸乙酯部位经硅胶柱、Sephadex?LH?20柱色谱和半制备液相进行分离纯化后，得到二氢杨梅素?3?O?没食子酸。本发明方法提取率高，所提取的化合物纯度高。

主权利要求：
1.一种角豆树果荚中二氢杨梅素?3?O?没食子酸的提取方法，其特征在于，包括：提供粉碎至60?80目的角豆树去种子的果荚；
先用80?95%乙醇提。儆60?75%乙醇提。喜⑻崛∫号ㄋ醭山膏；
将所得浸膏用水稀释分散，经大孔吸附树脂D101吸附，先用蒸馏水洗脱除去杂质；再用
95%乙醇洗脱，将所得洗脱液回收溶剂；用甲醇分散，依次经石油醚、乙酸乙酯萃。
将乙酸乙酯萃取部位回收溶剂，然后经硅胶柱、SephadexLH?20柱色谱和半制备液相进行分离纯化，得到二氢杨梅素?3?O?没食子酸；
将乙酸乙酯部位采用硅胶柱色谱分离时，采用石油醚?乙酸乙酯=（1:1）?（3:1）体积比洗脱；
采用SephadexLH?20柱色谱分离时，采用二氯甲烷?甲醇=1:1体积比洗脱；
采用半制备液相分离时，其中柱Ⅰ采用体积比为45:55的甲醇:纯化水洗脱，吸收波长：
210nm；柱Ⅱ采用体积比为37:63的甲醇:纯化水洗脱，吸收波长：210nm；
所述二氢杨梅素?3?O?没食子酸的结构式如下：。
2.根据权利要求1所述角豆树果荚中二氢杨梅素?3?O?没食子酸的提取方法，其特征在于，用80?95%乙醇提取时，80?95%乙醇与角豆树去种子的果荚的重量比为（5?10）:1。
3.根据权利要求2所述角豆树果荚中二氢杨梅素?3?O?没食子酸的提取方法，其特征在于，用80?95%乙醇提取2?3次，每次1?3小时。
4.根据权利要求1?3任一项所述角豆树果荚中二氢杨梅素?3?O?没食子酸的提取方法，其特征在于，用60?75%乙醇提取时，60?75%乙醇与角豆树去种子的果荚的重量比为（5?10）:
1。
5.根据权利要求4所述角豆树果荚中二氢杨梅素?3?O?没食子酸的提取方法，其特征在于，用60?75%乙醇提取2?3次，每次1?3小时。 说明书 : 角豆树果荚中二氢杨梅素?3?O?没食子酸的提取方法技术领域[0001] 本发明涉及医药领域，具体涉及角豆树果荚中二氢杨梅素?3?O?没食子酸的提取方法。背景技术[0002] 角豆(CeratoniasiliquaL.)，原产于地中海东部，目前在国内已由人工引种栽培。角豆具有非常高的营养价值，富含矿物质及微量元素，含有的单宁、多酚类物质具有药用价值。[0003] 氧化应激反应是导致疾病和衰老的一种重要因素，抗氧化损伤是人类对抗衰老，预防机体损伤行之有效的方式。没食子酸和二氢杨梅素都具有抗氧化等多种生物活性，均可通过化学方法提取获得，但在提取过程中使用强酸或强碱等溶剂，造成环境污染和设备腐蚀及操作人员：，且存在反应不完全，质量不稳定(易被氧化)，提取率低，提取难度大。发明内容[0004] 本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。[0005] 从角豆树果荚中提取分离二氢杨梅素?3?O?没食子酸，因杂质多且化合物不稳定，导致提取率非常低，提纯难度较大。本发明意外发现，通过梯度浓度乙醇提。梢宰柚苟氢杨梅素?3?O?没食子自氧化，显著提高了二氢杨梅素?3?O?没食子酸纯度。本发明提供角豆树果荚中二氢杨梅素?3?O?没食子酸的提取方法，提取率高，所提取的化合物纯度高。本发明提取方法从角豆树果荚中提取二氢杨梅素?3?O?没食子酸的提取纯度较高，能达到99.50％?99.99％。[0006] 一种角豆树果荚中二氢杨梅素?3?O?没食子酸的提取方法，包括：提供经粉碎的角豆树去种子的果荚；先用80?95％乙醇提。儆60?75％乙醇提。喜⑻崛∫号ㄋ醭山膏；将所得浸膏用水稀释分散，经大孔吸附树脂D101吸附，先用蒸馏水洗脱除去杂质(主要是糖类杂质)；再用95％乙醇洗脱，将所得洗脱液回收溶剂；用甲醇分散，依次经石油醚、乙酸乙酯萃。唤宜嵋阴ポ腿〔课换厥杖芗，然后经硅胶柱、SephadexLH?20柱色谱和半制备液相进行分离纯化，得到二氢杨梅素?3?O?没食子酸。[0007] 根据本发明实施例，所述角豆树为豆科长豆角属植物角豆树(学名：CeratoniasiliquaLinn.)。[0008] 根据本发明实施例，角豆树去种子的果荚粉碎至60?80目。研究发现，在此粒径内可以充分破碎果荚细胞结构，有利于二氢杨梅素?3?O?没食子酸的充分溶出。[0009] 根据本发明实施例，先用80?95％(例如80％、85％、90％、95％)乙醇提。儆60?75％(例如60％、65％、70％、75％)乙醇提。芯糠⑾，这样可以增加二氢杨梅素?3?O?没食子酸提取率。[0010] 根据本发明实施例，第一次用80?95％乙醇提取时，80?95％乙醇与角豆树去种子的果荚的重量比为(5?10):1，具体例如5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1。研究发现，这样有利于沉淀除去部分有害杂质，防止二氢杨梅素?3?O?没食子酸发生自氧化。[0011] 根据本发明实施例，第一次用80?95％乙醇提取2?3次，每次1?3小时。[0012] 根据本发明实施例，第二次用60?75％乙醇提取时，60?75％乙醇与角豆树去种子的果荚的重量比为(5?10):1，具体例如5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1。研究发现，这样有利于增加二氢杨梅素?3?O?没食子酸的溶解度，提高提取率。根据本发明实施例，第二次用60?75％乙醇提取2?3次，每次1?3小时。[0013] 研究发现，用大孔吸附树脂D101吸附可以分离可离子化物质、糖类物质、大分子物质。[0014] 根据本发明实施例，所用甲醇的浓度为50?60％。[0015] 研究发现，用石油醚、乙酸乙酯萃取可以分离分配系数不同物质。[0016] 根据本发明实施例，将乙酸乙酯部位采用硅胶柱色谱分离时，采用石油醚?乙酸乙酯((1:1)?(3:1)，具体例如1:1、2:1、3:1，体积比)洗脱。[0017] 研究发现，用硅胶柱、SephadexLH?20柱色谱和半制备液相进行分离纯化可以获得高纯度、高收率二氢杨梅素?3?O?没食子酸。[0018] 根据本发明实施例，采用SephadexLH?20柱色谱分离时，采用二氯甲烷?甲醇＝1:1(体积比)洗脱。[0019] 根据本发明实施例，采用半制备液相分离时，其中柱Ⅰ采用甲醇:纯化水＝45:55(体积比)洗脱，吸收波长：210nm；柱Ⅱ采用甲醇:纯化水＝37:63(体积比)洗脱吸收波长：210nm。[0020] 本发明所述二氢杨梅素?3?O?没食子酸的结构式如下，[0021][0022] 本发明还提供二氢杨梅素?3?O?没食子酸在制备具有抑菌和/或抗病毒的药物中的应用。[0023] 根据本发明实施例，所述菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌。根据本发明实施例，所述病毒包括：甲型流感病毒，具体例如A/PR/8/34病毒株。[0024] 本发明角豆果荚中二氢杨梅素?3?O?没食子酸的提取方法，提取率高，二氢杨梅素?3?O?没食子酸的纯度能达到98.50％?99.80％以上。本发明首次将二氢杨梅素?3?O?没食子应用于抑菌、抗病毒，发现具有显著的抗菌、抗病毒、抗氧化作用。附图说明[0025] 图1为本发明实施例1提取得到的二氢杨梅素?3?O?没食子酸核磁共振检测图谱。具体实施方式[0026] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。[0027] 以下角豆树果荚为豆科长豆角属植物角豆树(拉丁学名：CeratoniasiliquaLinn.)干燥的果荚。[0028] 以下二氢杨梅素?3?O?没食子酸纯度的检测方法参考文献“高效液相色谱法测定藤茶中二氢杨梅素和杨梅素含量”(陈图锋，等.亚太传统医药，第11卷第1期)。[0029] 以下提取率的计算方法为：[0030] 二氢杨梅素?3?O?没食子酸提取率％＝分离流分/角豆荚粗粉×100％[0031] 注：分离流分指半制备液相分离流出的总成分。[0032] 实施例1[0033] 取干燥的角豆树去种子果荚，粉碎得到60目粗粉，加入粗粉7倍重量的90％乙醇回流提取2次(每次1.5小时)，再用粗粉8倍重量的60％乙醇回流提取1次(1.5小时)，合并提取液浓缩得到浸膏。用5份重量的水将浸膏分散，经大孔吸附树脂D101进行吸附，用蒸馏水洗脱3个柱体积除去糖类等杂质，再用95％乙醇洗脱3个柱体积，回收溶剂后得到非糖类小分子部位。将得到的非糖类小分子部位用4倍重量的50％甲醇分散，依次使用石油醚、乙酸乙酯分别萃取5次，回收溶剂后分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位。[0034] 将乙酸乙酯部位回收溶剂，采用200目硅胶柱色谱分离，采用石油醚?乙酸乙酯(3:1)洗脱，TLC薄层检识，合并相似流份。[0035] 流份经SephadexLH?20柱色谱(二氯甲烷?甲醇＝1:1，体积比)，然后用半制备液相(柱Ⅰ，甲醇:纯化水＝45:55，体积比，吸收波长：210nm；柱Ⅱ，甲醇:纯化水＝37:63，体积比)分离，获得二氢杨梅素?3?O?没食子酸。[0036] 本实施例提取率为52.5％。提取得到的二氢杨梅素?3?O?没食子酸纯度为98.50％，其核磁共振检测图谱见图1。[0037] 实施例2[0038] 取干燥的角豆树去种子果荚，粉碎得到60目粗粉，加入粗粉10倍重量的80％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，再用粗粉5倍重量的65％乙醇回流提取1次，每次1.5小时，[0039] 合并提取液浓缩得到浸膏，用5倍重量的水将浸膏分散，经大孔吸附树脂D101进行吸附，用蒸馏水洗脱3个柱体积除去糖类等杂质，再用95％乙醇洗脱3个柱体积，回收溶剂后得到非糖类小分子部位。将得到的非糖类小分子部位用5倍重量的50％甲醇分散，依次使用石油醚、乙酸乙酯分别萃取5次，回收溶剂后分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位。[0040] 将乙酸乙酯部位回收溶剂，采用300目硅胶柱色谱分离，采用石油醚?乙酸乙酯(2:1)洗脱，TLC薄层检识，合并相似流份。[0041] 流份经SephadexLH?20柱色谱(二氯甲烷?甲醇＝1:1，体积比)，然后用半制备液相(柱Ⅰ，甲醇:纯化水＝45:55，体积比，吸收波长：210nm；柱Ⅱ，甲醇:纯化水＝37:63，体积比，吸收波长：210nm)分离。获得二氢杨梅素?3?O?没食子酸。[0042] 本实施例提取率为50.2％。提取得到的二氢杨梅素?3?O?没食子酸纯度为98.80％。[0043] 实验例3[0044] 取角豆树果荚去种子，粉碎后过80目药筛，得到角豆树果荚粗粉。然后加入粗粉8倍重量的95％乙醇回流提取3次(每次1.5小时)，再用粗粉10倍重量的70％乙醇回流提取1次(1.5小时)，合并提取液浓缩得到浸膏。用5倍重量的水将浸膏分散，经大孔吸附树脂D101进行吸附，用蒸馏水洗脱3个柱体积除去糖类等杂质，再用95％乙醇洗脱3个柱体积，回收溶剂后得到非糖类小分子部位。将得到的非糖类小分子部位用2倍重量的50％甲醇分散，依次使用石油醚、乙酸乙酯分别萃取5次，回收溶剂后分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位。[0045] 将乙酸乙酯部位回收溶剂，采用250目硅胶柱色谱分离，采用石油醚?乙酸乙酯(1:1)洗脱，TLC薄层检识，合并相似流份。[0046] 流份经SephadexLH?20柱色谱，二氯甲烷?甲醇＝1:1(体积比)，然后用半制备液相(柱Ⅰ，甲醇:纯化水＝45:55，吸收波长：210nm；柱Ⅱ，甲醇:纯化水＝37:63，吸收波长：210nm)分离。获得二氢杨梅素?3?O?没食子酸。[0047] 本实施例提取率为75％。提取得到的二氢杨梅素?3?O?没食子酸纯度为99.80％。[0048] 对比例1[0049] 与实施例1相比，区别仅在于角豆树去种子果荚粉碎后过40目药筛。[0050] 本实施例提取率为15％。提取得到的二氢杨梅素?3?O?没食子酸纯度为20.2％。[0051] 对比例2[0052] 与实施例1相比，区别仅在于第一次用60％乙醇提。诙次用90％乙醇提取。[0053] 本实施例提取率为10％。提取得到的二氢杨梅素?3?O?没食子酸纯度为12.4％。[0054] 对比例3[0055] 与实施例1相比，区别仅在于第一次用75％乙醇提。诙次用80％乙醇提取。[0056] 本实施例提取率为20％。提取得到的二氢杨梅素?3?O?没食子酸纯度为22.3％。[0057] 对比例4[0058] 与实施例1相比，区别仅在于：将乙酸乙酯部位采用硅胶柱色谱分离时，采用石油醚?乙酸乙酯(1:3，体积比)。[0059] 本实施例提取率为31.5％。提取得到的二氢杨梅素?3?O?没食子酸纯度为73.1％。[0060] 对比例5[0061] 与实施例1相比，区别仅在于半制备液相为柱Ⅰ，甲醇:纯化水＝37:63(体积比)吸收波长：210nm，柱Ⅱ，甲醇:纯化水＝45:55(体积比)吸收波长：210nm。[0062] 本实施例提取率为43.7％。提取得到的二氢杨梅素?3?O?没食子酸纯度为82％。[0063] 实验例1[0064] 实验样品：实施例1制备的二氢杨梅素?3?O?没食子酸。[0065] 安全性评价：依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)。[0066] 急毒性试验：[0067] 1、实验动物：成年大鼠，性别随机，体重180?220g。[0068] 2、试验分组：每组5只，共分3组，低剂量组每只大鼠给予二氢杨梅素?3?O?没食子酸1g，中剂量组每只大鼠给予二氢杨梅素?3?O?没食子酸1.2g，高剂量组每只大鼠给予二氢杨梅素?3?O?没食子酸1.4g。[0069] 3、喂养7天，记录死亡大鼠数量。[0070] 结果：7天内，未出现死亡大鼠。[0071] 遗传毒性与30天喂养试验：[0072] 1、实验动物：成年雄性小鼠，6?8周龄，体重25?35g。[0073] 2、试验分组：每组5只，分低、中、高3个剂量组和一个空白对照组。低剂量组每只小鼠给予二氢杨梅素?3?O?没食子酸1g；中剂量组每只小鼠给予二氢杨梅素?3?O?没食子酸1.2g；高剂量组每只小鼠给予二氢杨梅素?3?O?没食子酸1.4g；阴性空白对照组，给予1.0g蒸馏水。[0074] 3、喂养30天取血后处死，对照阴性，观察精子畸形率、各脏器组织学检查。[0075] 结果：与对照组比较，均未出现统计学意义的精子畸形。血常规和脏器检查，与对照组比较，均未出现统计学意义的变化。[0076] 实验例2[0077] 实验样品：以实施例1、实施例2和对比例1制备的二氢杨梅素?3?O?没食子酸，制成颗粒剂，每5g颗粒剂中二氢杨梅素?3?O?没食子酸的含量为100mg。[0078] 抗氧化测试：依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)。[0079] 1、受试者纳入标准：选年龄在45?65岁，身体健康状况良好，无明显器质病变，无长期服药史，自愿参与并保证配合完成。[0080] 2、受试者分组：对受试者按SOD、GSH?Px水平随机分为试食组1?3和对照组，每组受试者为50例，分为试食组1、试食组2、试食组3，服用剂量均为5g/天，其中试食组1为实施例1制备得到化合物，试食组2为实施例2制备得到的化合物，试食组3为对比例1制备得到的化合物。[0081] 3、试验方法：采用自身和组间两种对照设计。试食组1、试食组2、试食组3按5g/天，试食90天，服用含有本发明成分的角豆提取物，对照组服用相同剂量的安慰剂(淀粉)。试验期间原生活及饮食不变。[0082] 4、结果判定：测量血中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH?Px)、超氧化物歧化酶(SOD)。结果见表1。[0083] 表1试食前后GSH?Px、SOD的变化率[0084] 组别 GSH?Px平均变化率(％) SOD平均变化率(％)对照组 ?0.28±0.04* ?1.19±0.01*试食组1 2.78±0.16#** 3.28±0.04#**试食组2 2.76±0.25#** 4.13±0.03#**试食组3 2.00±0.31#** 2.67±0.02#**[0085] 试食组自身对照，GSH?Px、SOD变化率均显著升高，#p<0.01。对照组自身对照GSH?Px、SOD变化率均显著降低，*p<0.01，试食组与对照组比较，GSH?Px、SOD变化率均显著升高，**p<0.01。通过上述试食实验，验证了本发明角豆提取物具有抗氧化功效。[0086] 通过上述安全性和抗氧化试验，证实首次于角豆荚中发现并提取高纯度的二氢杨梅素?3?O?没食子酸，具有食用安全，抗氧化性能好的特点，适于推广和食用。[0087] 实验例3[0088] 实验材料：MDCK细胞(犬肾细胞)，用于培养流感病毒的传代细胞株，购自中国药品与生物制品检定所，经复苏传代后使用。用含胎牛血清的培养液、在37℃、5％CO2培养箱中培养；甲型流感病毒选用A/PR/8/34病毒株，血清型为H1N1，购自国家流感中心。[0089] 实验方法：按100μL/孔，在96孔培养板的MDCK单层细胞中加入终浓度为100×TCID50流感病毒液，置37℃，5％CO2培养箱中吸附2h。吸弃病毒液，用无血清培养基DMEM洗涤两次，然后分别加入不同剂量二氢杨梅素?3?O?没食子酸(实施例1制备)、利巴韦林。采用MTT法测定OD值，计算病毒抑制率。[0090] 实验分组：正常细胞组；阴性对照组；阳性对照组：给予利巴韦林0.05mg/mL；药物组：给予二氢杨梅素?3?O?没食子酸，浓度分别为0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.08mg/mL。[0091] 实验结果见表2。[0092] 表2[0093][0094] 结果：相对于阴性对照组*p＜0.01，均具有显著差异。药物组中的高剂量组相对于阳性对照组#p＞0.01，不具有显著差异，说明二氢杨梅素?3?O?没食子酸具有抑制流感病毒作用。[0095] 实验例4[0096] 实验材料：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌：购自于中国菌种保藏中心。实验方法：琼脂打孔抑菌圈，取各供试菌菌悬液100μL于对应琼脂平板上，涂布均匀，每个平板上用100μL枪头打孔，向孔中注入测试物，平板置于37℃恒温培养24h后测抑菌圈直径。[0097] 实验分组：空白组；二氢杨梅素?3?O?没食子酸组(实施例1制备)：低剂量组浓度0.02mg/mL，中剂量组浓度0.04mg/mL，高剂量组浓度0.08mg/mL。取以上各组溶液20μL加入到琼脂孔中。[0098] 实验结果如下表3，二氢杨梅素?3?O?没食子酸三个剂量组均表现出具有抑制有害菌的作用。[0099] 表3[0100][0101] 注：?表示没有显著的抑菌圈。[0102] 虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

专利地区：吉林

专利申请日期：2023-04-04

专利公开日期：2024-09-27

专利公告号：2024-09-27