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专利名称：醋酸杆菌和含有该菌的菌剂、以及它们的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310191332.1

专利申请（专利权）人：广西酵本生物技术有限公司
权利人地址：广西壮族自治区河池市金城江区金城江街道大任产业园兴和路药融园内

专利发明（设计）人：曾俊华,陈帅,陈双

专利摘要：本发明提供了一种醋酸杆菌和含有该菌的菌剂、以及它们的应用。所述醋酸杆菌命名为醋酸杆菌JBD6，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC?NO：M?20221826。在本发明提供的醋酸杆菌产生的酶的作用下，巴豆醛能够转化为巴豆酸，实现生物法制备巴豆酸，与现有技术的化学合成法相比，具有反应条件温和、转化率高、副产物少、安全高效、环境友好、无污染等优点。

主权利要求：
1.一种醋酸杆菌，其特征在于，所述醋酸杆菌命名为醋酸杆菌JBD6，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCNO：M20221826。
2.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有权利要求1所述的醋酸杆菌的活菌体。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为将醋酸杆菌进行发酵培养得到的菌液或者为将所述菌液固液分离得到的菌体。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为将所述菌液分离得到的湿菌体。
5.权利要求1所述的醋酸杆菌或者权利要求2至4任一项所述的菌剂在氧化巴豆醛制备巴豆酸的方法中的应用。
6.一种氧化法制备巴豆酸的方法，其特征在于，将权利要求1所述的醋酸杆菌和/或权利要求2至4任一项所述的菌剂与含有巴豆醛的水溶液进行接触。
7.根据权利要求6所述的氧化法制备巴豆酸的方法，其特征在于，所述接触的过程包括：将所述醋酸杆菌和/或所述菌剂与含有巴豆醛的水溶液进行混合得到混合液，在搅拌状态下，所述混合液中的巴豆醛在所述醋酸杆菌和/或所述菌剂产生的酶的作用下转化生成3
巴豆酸，其中，转化条件包括：转化温度为28～36℃，转化时间为1～24h，通空气量为0.1m /h。 说明书 : 醋酸杆菌和含有该菌的菌剂、以及它们的应用技术领域[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种醋酸杆菌和含有该菌的菌剂、以及它们的应用。背景技术[0002] 巴豆酸，又名丁烯酸，分子中含有双键和羧基，有顺式和反式两种结构，是一种重要的中间体，用途十分广泛。在工业上主要用于制备各种树脂、表面涂料、杀菌剂、增塑剂等，同时也是重要的医药中间体、农药中间体。巴豆酸作为一种不饱和脂肪酸，最主要的用途是作为聚醋酸乙烯涂料的原料。[0003] 目前，巴豆醛转化为巴豆酸的生产方法主要为化学合成法，以氧化催化巴豆醛为主，但化学合成法普遍具有能耗大、成本高、反应路线复杂等缺陷。发明内容[0004] 本发明的目的在于提供一种以巴豆醛为原料，生物法制备巴豆酸的醋酸杆菌，以解决化学合成法存在的缺陷，具有反应温和、转化率高等优点。[0005] 本发明提供一种醋酸杆菌，所述醋酸杆菌命名为醋酸杆菌JBD6，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCNO：M20221826。[0006] 本发明还提供一种菌剂，该菌剂含有上文所述的醋酸杆菌的活菌体。[0007] 在一种具体的实施方式中，所述菌剂为将醋酸杆菌进行发酵培养得到的菌液或者为将所述菌液固液分离得到的菌体。[0008] 在一种具体的实施方式中，所述菌剂为将所述菌液分离得到的湿菌体。[0009] 本发明还提供一种上文所述的醋酸杆菌或者上文所述的菌剂在氧化巴豆醛制备巴豆酸的方法中的应用。[0010] 在一种具体的实施方式中，所述醋酸杆菌具有耐高醛和耐高酸的能力。[0011] 在一种具体的实施方式中，所述醋酸杆菌至少耐受20g/L巴豆酸。[0012] 本发明还提供一种氧化法制备巴豆酸的方法，将上文所述的醋酸杆菌和/或上文所述的菌剂与含有巴豆醛的水溶液进行接触。[0013] 在一种具体的实施方式中，所述接触的过程包括：将所述的醋酸杆菌和/或所述菌剂与含有巴豆醛的水溶液进行混合得到混合液，在搅拌状态下，所述混合液中的巴豆醛在所述醋酸杆菌和/或所述菌剂产生的酶的作用下转化生成巴豆酸，其中，转化条件包括：转3化温度为28～36℃，转化时间为1～24h，通空气量为0.1m/h。[0014] 本发明还提供一种氧化法制备巴豆酸的方法，包括以下步骤：[0015] (1)对果园土壤悬液进行筛选分离得到耐高醛和耐高酸的醋酸杆菌，所述醋酸杆菌为上文所述的醋酸杆菌；[0016] (2)对所述醋酸杆菌进行发酵培养，得到含醋酸杆菌的菌液；[0017] (3)将所述菌液进行离心分离或者过滤分离得到湿菌体；[0018] (4)使所述湿菌体与含有巴豆醛的水溶液进行混合得到混合液，在搅拌状态下，所述混合液中的巴豆醛在所述湿菌体产生的酶的作用下转化生成巴豆酸，其中，转化条件包3括：转化温度为28～36℃，转化时间为1～24h，通空气量为0.1m/h。[0019] 本发明的有益效果至少包括：[0020] 在本发明提供的醋酸杆菌产生的酶的作用下，巴豆醛能够转化为巴豆酸，实现生物法制备巴豆酸，与现有技术的化学合成法相比，具有反应条件温和、转化率高、副产物少、安全高效、环境友好、无污染等优点。[0021] 生物保藏[0022] 本发明提供的菌株为醋酸杆菌JBD6，于2022年12月05日被保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏单位的简称为CCTCC，地址位于湖北省武汉市武汉大学，邮编430072)，保藏编号为CCTCCNO：M20221826。具体实施方式[0023] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以组合得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。[0024] 第一方面，本发明提供一种醋酸杆菌，所述醋酸杆菌命名为醋酸杆菌JBD6，于2022年12月05日被保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏单位的简称为CCTCC，地址位于湖北省武汉市武汉大学，邮编430072)，保藏编号为CCTCCNO：M20221826。[0025] 所述醋酸杆菌的16sDNA序列见SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。[0026] 第二方面，本发明提供一种菌剂，该菌剂含有上述的醋酸杆菌的活菌体。[0027] 根据本发明，对所述菌剂的剂型没有特别的限制，可以制备成不同的剂型，并添加相应的辅料等成分，如所述菌剂可以为液态菌剂和/或固态菌剂，例如可以为醋酸杆菌的扩大培养的发酵液(菌液)，或者为过滤发酵液或者离心发酵液得到的菌体。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种辅料为本领域技术人员所熟知，在此不再详细说明。[0028] 第三方面，本发明提供上述的醋酸杆菌、上述的菌剂在氧化巴豆醛制备巴豆酸的方法中的应用。[0029] 根据本发明，上述的醋酸杆菌、上述的菌剂可以用于氧化巴豆醛制备巴豆酸，相对于化学合成法，具有反应温和、环境友好、转化率高、操作简单、副产物少等优点。[0030] 第四方面，本发明还提供一种氧化法制备巴豆酸的方法，将上述的醋酸杆菌和/或上述菌剂与含有巴豆醛的水溶液进行接触。[0031] 其中，所述接触的过程包括：将所述的醋酸杆菌和/或所述菌剂与含有巴豆醛的水溶液进行混合得到混合液，在搅拌状态下，所述混合液中的巴豆醛在所述醋酸杆菌和/或所述菌剂产生的酶的作用下转化生成巴豆酸，其中，转化条件包括：转化温度为25～36℃，转3化时间为1～24h，通空气量为0.1m/h。[0032] 氧化巴豆醛生产巴豆酸的反应方程式为：[0033][0034] 第五方面，本发明还提供一种氧化法制备巴豆酸的方法，包括以下步骤：[0035] 步骤一、对果园土壤悬液进行筛选分离得到耐高醛和耐高酸的醋酸杆菌，所述醋酸杆菌为上文所述的醋酸杆菌；[0036] 本发明提供的醋酸杆菌从果园土壤悬液中分离得到，通过采用特定的培养基，使筛选分离得到的醋酸杆菌具有耐高醛和耐酸性能。具体地，具有耐高醛和耐酸性能的醋酸杆菌的筛选方法包括以下步骤：[0037] 步骤(1)、将果园土壤悬液加到第一培养基中，置于摇床上进行振荡培养得到一级菌液，所述第一培养基的组成为：酵母膏1g/L、葡萄糖3g/L、巴豆酸1g/L；[0038] 步骤(1)的振荡培养条件为：培养温度30℃，培养时间48h；[0039] 步骤(2)、取10mL一级菌液接种到100mL第一培养基中，置于摇床上进行振荡培养得到二级菌液；[0040] 步骤(2)的振荡培养条件为：培养温度30℃，培养时间24h；[0041] 步骤(3)、将所述二级菌液用无菌水稀释10倍得到稀释菌液，将所述稀释菌液涂布于第二培养基上，培养结束后得到多个单菌，在所述多个单菌中挑选有透明圈的单菌转接至斜面保藏培养基，保存得到较耐酸醋酸杆菌；所述第二培养基为固体培养基，其组成为：酵母膏1g/L、葡萄糖3g/L、巴豆酸1g/L、琼脂2％；[0042] 步骤(3)的培养条件为：于28℃生化培养箱培养72h；[0043] 步骤(4)、将得到的较耐酸醋酸杆菌转接于第三培养基中，置于摇床上进行振荡培养得到醋酸杆菌菌株种子液；所述第三培养基的组成为：酵母膏1g/L、葡萄糖3g/L；[0044] 步骤(4)的培养条件为：培养温度30～40℃，培养时间24h；[0045] 步骤(5)、取相同体积的所述醋酸杆菌菌株种子液分别接种于含有体积分数为0％、5％、15％、20％、25％的巴豆醛的第三培养基中，置于摇床上进行振荡培养，培养完成后测定OD值和产本值，根据测定结果筛选第一目标菌株；[0046] 步骤(5)的培养条件为：培养温度30～40℃，培养时间为48h。[0047] 步骤(6)、等离子体放电技术诱变第一目标菌株，并筛选出耐高醛和耐酸的第二目标菌株，等离子体放电技术诱变具体为在高压电场下采用“针一板”电极进行诱变。[0048] 步骤(6)具体为：[0049] 将甘油保存的第一目标菌株涂布后置于电极之间，通入氦气，放电电压为6kV，诱变时间为2min；取出诱变的菌液，在超净工作台内涂布后转到恒温培养箱中进行培养，其中，培养条件为培养温度28℃，培养时间72h；将培养完成后的菌落根据大小、形态进行初筛，筛选出生长旺盛或者是形态发生明显变化的菌株；将初筛得到的菌株分别接种于含有体积百分数为0％、5％、15％、20％、25％的巴豆醛的第三培养基中，置于摇床上进行振荡培养，培养完成后测定OD值和产酸值，根据测定结果筛选第二目标菌株，所述第二目标菌株作为完成筛选得到的醋酸杆菌；[0050] 步骤(6)摇床的振荡培养条件为：培养温度30～40℃，培养时间为24h。[0051] 步骤二、对所述醋酸杆菌进行发酵培养，得到含醋酸杆菌的菌液；[0052] 根据所需要获取的菌液量对所述醋酸杆菌进行一级种子培养，或者一级种培养和二级种子培养，或者一级种子培养、二级种子培养和发酵罐培养。具体地：[0053] 一级种子培养：将所述醋酸杆菌活化后，进行一级种子培养得到一级种，其中，一级种培养的容器为：种子摇瓶，一级种子培养条件为：培养温度28～35℃，培养周期为10～24h，一级种子培养基为：酵母浸粉0～1g/L、鱼蛋白胨0～1g/L、(骨)蛋白胨0～2g/L、大豆蛋白胨0～1g/L、葡萄糖0～3g/L、磷酸氢二钾0～0.5g/L、磷酸氢二铵0～0.8g/L、硫酸镁0～0.6g/L、烟酰胺0～0.6g/L、天冬氨酸0～0.9g/L、胆碱0～0.8g/L、琥珀酸0～0.5g/L、醋酸钠0～0.5g/L、消泡剂0～2g/L；[0054] 优选地，一级种子培养基的pH值为4～8，可以用氨水调节。[0055] 二级种子培养：将所述一级种按5～10％的接种量接种至二级种子培养基中进行二级种子培养得到二级种，其中，二级种培养的容器为三角瓶；二级种子培养条件为培养温度28～35℃，培养周期为10～24h；二级种子培养基与一级培养基相同。[0056] 优选地，二级种子培养基的pH值为4～8，可以用氨水调节。[0057] 发酵罐培养：将所述二级种按5～10％的接种量接种至三级种子培养基中进行三级种子培养得到三级种，其中，三级种培养的容器为发酵罐；三级种子培养条件为：培养温度30～35℃，培养周期为10～24h；三级种子培养基组成为：酵母粉0～15g/L、鱼蛋白胨0～3g/L、(骨)蛋白胨0～30g/L、大豆蛋白胨0～4g/L、磷酸氢二钾0～3g/L、硫酸镁0～0.5g/L、烟酰胺0～0.3g/L、天冬氨酸0～0.9g/L、醋酸钠0～5g/L、胆碱0～0.3g/L、维生素B0～4g/L、消泡剂0～3g/L。[0058] 优选地，三级种子培养基的pH值为6～8，采用氨水调节pH值。[0059] 三级种子培养过程为：接种后，当pH值小于4.5时，加入氨水控制pH值为4～6，培养3/温度32.5℃，通空气量0.2m h，搅拌速度为400rpm；当溶氧小于10％时，调节搅拌速度为500rpm。[0060] 步骤三、将所述菌液进行固液分离得到湿菌体；[0061] 此步骤的固液分离包括离心分离或者过滤分离，具体地，在本发明申请中，进行过滤分离时，采用膜孔径为100μm的陶瓷膜过滤所述菌液得到湿菌体。[0062] 步骤四、使所述湿菌体与含有巴豆醛的水溶液进行混合得到混合液，在搅拌状态下，所述混合液中的巴豆醛在所述醋酸杆菌和/或所述菌剂产生的酶的作用下转化生成巴3豆酸，其中，转化条件包括：转化温度为28～36℃，转化时间为1～24h，通空气量为0.1m/h。[0063] 优选地，所述转化液中巴豆醛的起始含量为0～20g/L。[0064] 优选地，所述转化条件还包括搅拌速度为400rpm。[0065] 具体地，将过滤得到的湿菌体投入含有巴豆醛的水溶液反应体系中进行转化，控制转化温度为转化温度为28～36℃，转化时间为1～24h，搅拌速度为400rpm，通空气量为3/0.1m h，每小时记录溶氧、DO、pH值，其中，转化液中巴豆醛的起始含量为0～20g/L。[0066] 在巴豆醛转化为巴豆酸的反应过程中，起催化作用的为湿菌体在转化温度下产生的酶。[0067] 本发明提供的氧化法制备巴豆酸的方法，还包括将反应后的转化液转化为巴豆酸固体的步骤。[0068] 该步骤为步骤五，具体为：采用膜孔径为100μm的陶瓷膜过滤反应后的转化液得到菌体和滤液，使所述滤液经纳滤膜脱色后，再采用RO膜浓缩，直至浓缩液中巴豆酸含量100g/L时，停止浓缩，收集浓缩液；使用异丙醇对浓缩液进行萃。∩锨逡号ㄋ豕说玫桨投顾峁烫，经干燥后得到巴豆酸粉剂产品，其中，RO膜的膜孔径为500Da，萃取的次数为2～3次，干燥的设备为热风循环烘箱，干燥的温度为50℃，烘干直至巴豆酸粉剂产品的质量不再变化，则烘干完成。[0069] 实施例1[0070] 菌株的筛选[0071] 配制菌株筛选用的基础培养基，称量10克酵母膏和30克葡萄糖置于水中，并定容至10L水，加热溶解，调pH至3～5，121℃灭菌20min。[0072] 土壤筛选菌株：取制备的果园土壤悬液添加到含巴豆酸的液体培养基(基础培养基中加入巴豆酸配制得到，其中，巴豆酸的含量为1g/L)中，并置于摇床上振荡培养(培养温度30℃，培养时间48h)，得到一级菌液；将振荡培养后的一级菌液10ml接种到100ml含巴豆酸的液体培养基(基础培养基中加入巴豆酸配制得到，其中，巴豆酸的含量为1g/L)中，置于摇床振荡培养(培养温度30℃，培养时间24h)，得到二级菌液；将得到的二级菌液用无菌水稀释10倍得到稀释菌液，取稀释菌液涂布于含巴豆酸的固体培养基(基础培养基中加入巴豆酸和琼脂配制得到，其中，巴豆酸的含量为1g/L、琼脂为2％)上培养(于28℃生化培养箱培养72h)；培养结束后挑选有透明圈的单菌落转接至斜面保藏培养基，保存得到较耐酸醋酸杆菌；将得到的醋酸杆菌转接于基础培养基中，振荡培养(培养温度30℃，培养时间24h)后得到醋酸杆菌菌株种子液；将制得的醋酸杆菌菌株种子液(接种量为5％)分别接种于含有体积百分数为0％、5％、15％、20％、25％的巴豆醛的液体培养基中(基础培养基中加入巴豆醛配制得到)，分别记作实验1.1、实验1.2、实验1.3、实验1.4和实验1.5，置于摇床培养震荡摇床，30℃培养48h，分别检测OD值和产酸量，记录检测数据，其中，OD值分别是0.126A、0.131A、0.137A、0.142A、0.148A；产酸量分别是0％、4.7％、14.4％、18.3％、22.8％。实验1.5对应的菌株的OD值和产酸量均最大，根据测定结果筛选出实验1.5对应的醋酸杆菌作为第一目标菌株，制作甘油管保存，记作实验1.5#菌株。[0073] 等离子体放电技术诱变细菌定向筛选菌株：在高压电场下采用“针—板”电极进行诱变。具体方法为被诱变菌种将甘油保存的实验1.5#菌种涂布后置于电极之间。将被诱变样品通入氦气，放电电压在6kV，诱变时间2min；取出诱变的菌液，在超净工作台内涂布后转移到恒温培养箱中培养(培养温度28℃、培养时间72h)；将培养完成后的菌落根据大小、形态进行初筛。筛选出生长旺盛或者形态发生明显变化的菌株；将初筛的醋酸杆菌菌株(接种量为5％)分别接种于含有体积百分数为0％、5％、15％、20％、25％的巴豆醛的液体培养基(基础培养基中加入巴豆醛配制得到)中，分别记作实验2.1、实验2.2、实验2.3、实验2.4和实验2.5，置于摇床培养震荡摇床，培养温度30～40℃，培养时间24h，测定OD值和产酸量，记录检测数据，其中，OD值分别是0.132A、0.138A、0.144A、0.147A、0.159A；产酸量分别是0％、4.9％、14.9％、19.2％、24.9％。实验2.5对应的菌株的OD值和产酸量均最大，根据测定结果筛选出实验2.5得到的菌株作为第二目标菌株；将筛选出的第二目标菌株进行传代培养检测其遗传稳定性；效果最明显的第二目标菌株提取总DNA用细菌16SrDNA通用引物进行扩增，进行测序鉴定，命名为醋酸杆菌JBD6，送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M20221826。[0074] 菌种鉴定分析如下：[0075] 扩增的上游引物为27F，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；扩增的下游引物为1492R，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，菌株的16SrDNA核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，其中，SEQIDNO.1：AGTTTGATCMTGGCTCAG[0076] SEQIDNO.2：GGTTACCTTGTTACGACTT[0077] SEQIDNO.3：[0078][0079][0080] 将测序结果与nt库进行blast比对，鉴定该菌株为醋酸杆菌，其中NCBI检索号为CP039846.1，参考物种为：Acetobacterpasteurianus。[0081] 实施例2[0082] 配制1#培养基(种子培养基)和2#培养基(发酵罐培养基)[0083] 1#培养基的组成如下：酵母浸粉0.8g/L、鱼蛋白胨0.2g/L、(骨)蛋白胨0.35g/L、大豆蛋白胨0.2g/L、葡萄糖2g/L、磷酸氢二钾0.05g/L、磷酸氢二铵0.06g/L、硫酸镁0.6g/L、烟酰胺0.1g/L、天冬氨酸0.05g/L、胆碱0.18g/L、琥珀酸0.15g/L、醋酸钠0.35g/L、消泡剂0.02g/L；1#培养基为一级种子培养基和二级种子培养基；[0084] 2#培养基的组成如下：酵母粉9g/L、鱼蛋白胨3g/L、(骨)蛋白胨0.5g/L、大豆蛋白胨0.05g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸镁0.15g/L、烟酰胺0.13g/L、天冬氨酸0.09g/L、醋酸钠0.25g/L、胆碱0.03g/L、维生素B0.24g/L、消泡剂0.3g/L；[0085] 灭菌[0086] 将50mL1#培养基装至250mL三角瓶中，共1瓶，将200mL1#培养基装至1000mL三角瓶中，共3瓶，121℃灭菌25分钟；[0087] 将2#培养基调节pH为6～8(pH计)，然后121℃灭菌25分钟；[0088] 扩大培养[0089] 取CCTCCM20221826JBD6菌甘油管种子液0.4mL接种至装有1#培养基的250mL三角瓶中进行一级培养，具体为摇床培养，培养温度为30℃，培养时间为24h；然后再按5％的接种量接种至装有1#培养基的1000mL三角瓶中进行二级培养，具体为摇床培养，培养温度为30℃，培养时间为24h，再按6％的接种量接种至2#培养基进行培养，发酵罐接种后，当pH3＜4.5时，开始氨水控pH4～6；培养温度32.5℃；通空气量0.2m/h、搅拌速度为400rpm；当溶氧<10％后调搅拌速度为500rpm，培养24小时，通过离心收集菌体。[0090] 转化反应[0091] 取40g湿菌体投入转化罐，用水做溶剂，转化总体积10L，称取100g巴豆醛一次性加3入到转化罐中转化，控制搅拌400rpm、通空气量0.1m/h、转化温度30～35℃；反应24小时，结束后离心去除菌体，收集转化液。[0092] 样品的检测分析[0093] 转化液采用Agilent1260Infinity∏PrimeLC高效液相色谱仪检测分析，色谱条件为：流动相是磷酸缓冲液(pH＝2.0)?乙腈(40：60)、采用YMC?TriartC18色谱柱(4.6×150mm，3μm)，流速0.4ml/min、柱温25℃、进样量1μl、运行时间7min，检测器波长206nm。[0094] 需要说明的是，下文的实施例中的样品检测分析方法实施例2的样品的检测分析方法。[0095] 经检测，反应完成后的转化液中巴豆酸的浓度为12.28mg/mL，无巴豆醛剩余。[0096] 基于实施例2的实验数据可知，保藏编号为CCTCCM20221826JBD6的醋酸杆菌能够将巴豆醛转化为巴豆酸，实现生物法制备巴豆酸，可以代替化学合成法，且具有反应温和、转化率高、操作简单、副产物少、环保节能等优点。[0097] 实施例3[0098] 配制3#培养基[0099] 3#培养基的组成为酵母浸粉0.8g/L、鱼蛋白胨0.2g/L、(骨)蛋白胨0.35g/L、大豆蛋白胨0.2g/L、葡萄糖2g/L、磷酸氢二钾0.05g/L、磷酸氢二铵0.06g/L、硫酸镁0.6g/L、烟酰胺0.1g/L、天冬氨酸0.05g/L、胆碱0.18g/L、醋酸钠0.5g/L、消泡剂0.02g/L。[0100] 灭菌[0101] 将100mL3#培养基装至500mL三角瓶中，共2瓶，121℃灭菌25分钟。[0102] 扩大培养[0103] 取CCTCCM20221826JBD6菌甘油管种子液5mL接种至3#培养基进行培养，具体为摇床培养，培养温度为30℃，摇床转速200rpm，培养时间为24h，培养完成后，将2份100mL发酵液分别离心，各得到0.80克、0.80克湿菌体；[0104] 转化实验[0105] 实验1：先将第(1)份菌体加入到100ml缓冲液(含0.05g的磷酸二氢钾和0.05g的磷酸氢二钾)中，再加入2.0mlBDQ进行转化，转化条件为28～30℃(卧式摇床)200rpm；实验2：先将第(2)份菌体加入到100ml缓冲液(含0.05g的磷酸二氢钾和0.05g的磷酸氢二钾)中，再加入2.0mlBDQ转化，转化条件为34～36℃；200rpm(大摇床)；第0h、4h、6h、23h测pH；第6h各补加2.0mlBDQ；[0106] 实验1和实验2对应的pH值结果为：[0107]反应时间 0h 4h 6h 23h转化液pH值/实验1 5.15 4.62 4.41 4.32转化液pH值/实验2 5.95 4.42 4.35 4.25[0108] 同时，实验1对应的转化液在23h后还有醛味，而实验2对应的转化液在23h后没有醛味。[0109] 将实验1对应的检测结果和实验2对应的检测结果可知，当转化温度为34～36℃时，巴豆醛具有更好的转化效果。优选地，转化温度为34～36℃。[0110] 实施例4[0111] 配制4#培养基[0112] 4#培养基的组成为酵母浸粉0.8g/L、鱼蛋白胨0.2g/L、(骨)蛋白胨0.35g/L、大豆蛋白胨0.2g/L、葡萄糖2g/L、磷酸氢二钾0.05g/L、磷酸氢二铵0.06g/L、硫酸镁0.6g/L、烟酰胺0.1g/L、天冬氨酸0.05g/L、胆碱0.18g/L、醋酸钠0.5g/L、消泡剂0.02g/L。[0113] 4#培养基与3#培养基的组成相同。[0114] 灭菌[0115] 将200mL4#培养基装至1000mL三角瓶中，共1瓶，121℃灭菌25分钟。[0116] 扩大培养[0117] 取CCTCCM20221826JBD6菌甘油管种子液10mL接种至4#培养基进行培养，具体为摇床培养，培养温度为30℃，摇床转速200rpm，培养时间为24h，培养完成后，取200mL发酵液(留取10mL)离心后，得菌体湿重1.942克，收集离心液；往离心液中加入2克葡萄糖、0.26克尿素，溶解后，氨水调pH6.0～6.23、再加入留取的10ml发酵液，32～35℃、200rpm培养24h后离心，得湿菌重2.025克(pH3.98、镜检疑似轻微染杆菌)。[0118] 转化实验[0119] 将2.025克湿菌体加入到100ml缓冲液(含0.05g的磷酸二氢钾和0.05g的磷酸氢二钾)后，加入2.5mlBDQ转化(500ml摇瓶)；转化条件：转化温度34～36℃，转速200rpm，第2h、4h再补各加2.5mlBDQ、6h补加1.5ml(等测完pH看情况再决定是否补加)共9mlBDQ。在第0h、2h、4h、6h分别测pH，pH测定结果为：0h：pH5.86；2h：pH4.16；4h：pH4.06；6h：pH3.95，基本无醛味。[0120] 从实施例4的实验数据，可知，离心得到的发酵液可以再次用于菌种培养，且再次培养出来的菌种用于将巴豆醛转化为巴豆酸时，具有较好的转化效果。[0121] 实施例5[0122] 配制培养基[0123] 5#培养基的组成为麦麸水溶液3g/L，酵母浸粉0.8g/L、鱼蛋白胨0.2g/L、(骨)蛋白胨0.35g/L、大豆蛋白胨0.2g/L、葡萄糖2.5g/L、磷酸氢二钾0.05g/L、磷酸氢二铵0.06g/L、硫酸镁0.6g/L、烟酰胺0.1g/L、天冬氨酸0.05g/L、胆碱0.18g/L、醋酸钠0.5g/L、维生素B0.01g/mL,消泡剂0.02g/L。[0124] 6#培养基的组成为酵母浸粉0.8g/L、鱼蛋白胨0.2g/L、(骨)蛋白胨0.35g/L、大豆蛋白胨0.2g/L、葡萄糖2.5g/L、磷酸氢二钾0.05g/L、磷酸氢二铵0.06g/L、硫酸镁0.6g/L、烟酰胺0.1g/L、天冬氨酸0.05g/L、胆碱0.18g/L、醋酸钠0.5g/L、消泡剂0.02g/L。[0125] 7#培养基的组成为酵母浸粉0.8g/L、鱼蛋白胨0.2g/L、(骨)蛋白胨0.35g/L、大豆蛋白胨0.2g/L、葡萄糖2g/L、磷酸氢二钾0.05g/L、磷酸氢二铵0.06g/L、硫酸镁0.6g/L、烟酰胺0.1g/L、天冬氨酸0.05g/L、胆碱0.18g/L、琥珀酸0.15g/L、醋酸钠0.35g/L、消泡剂0.02g/L。[0126] 8#培养基的组成为酵母浸粉0.8g/L、鱼蛋白胨0.2g/L、(骨)蛋白胨0.35g/L、大豆蛋白胨0.2g/L、葡萄糖2g/L、磷酸氢二钾0.05g/L、磷酸氢二铵0.06g/L、硫酸镁0.6g/L、烟酰胺0.1g/L、天冬氨酸0.05g/L、琥珀酸0.15g/L、消泡剂0.02g/L。[0127] 灭菌[0128] 将200mL5#培养基至8#培养基共四组培养基分别装至4个1000mL三角瓶中，共4瓶，调节pH值为4～8，121℃灭菌25分钟。[0129] 扩大培养[0130] 取CCTCCM20221826JBD6菌甘油管种子液10mL接种，摇床培养，发酵温度30℃，摇床转速200rpm，培养24小时；各取200mL发酵液离心得到湿菌体，称重、测pH值，结果如下：其中，5#培养基对应得到的湿菌体1.675g，pH4.8；6#培养基对应得到的湿菌体1.292g，pH3.83；7#培养基对应得到的湿菌体2.037g，pH4.34；8#培养基对应得到的湿菌体0.623g，pH3.82。[0131] 基于上述结果可知，采用7#培养基进行扩大培养，对应的湿菌体重量最大，即产率更高，且pH值位于2～6之间，所以优选7#培养基。[0132] 实施例6[0133] 实施例6同实施例2，其区别在于，实施例6采用的发酵培养基与实施例2不相同，实施例6对应的发酵培养基中，不含胆碱，对应的液相分析结果为：巴豆酸浓度为10.28mg/mL，剩余巴豆醛浓度为1.08mg/mL。[0134] 实施例6对应的发酵培养基为：酵母粉9g/L、鱼蛋白胨3g/L、(骨)蛋白胨0.5g/L、大豆蛋白胨0.05g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸镁0.15g/L、烟酰胺0.13g/L、天冬氨酸0.09g/L、醋酸钠0.25g/L、维生素B0.24g/L、消泡剂0.3g/L。[0135] 实施例7[0136] 实施例7同实施例2，其区别在于，实施例7采用的发酵培养基与实施例2不相同，实施例7对应的发酵培养基中，不含胆碱和消泡剂，对应的液相分析结果为：巴豆酸浓度为7.16mg/mL，剩余巴豆醛浓度为5.08mg/mL。[0137] 实施例7对应的发酵培养基为：酵母粉9g/L、鱼蛋白胨3g/L、(骨)蛋白胨0.5g/L、大豆蛋白胨0.05g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸镁0.15g/L、硫酸锌0.2g/L、烟酰胺0.13g/L、天冬氨酸0.09g/L、醋酸钠0.25g/L、维生素B0.24g/L。[0138] 将实施例2、实施例6和实施例7的液相分析结果比较可知，胆碱和消泡剂均是发酵培养基中不可缺少的组分，采用包括胆碱和消泡剂的发酵培养基培养出来的菌体具有更好的催化巴豆醛转化为巴豆酸的效果。[0139] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

专利地区：广西

专利申请日期：2023-03-02

专利公开日期：2024-09-27

专利公告号：2024-09-27