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专利名称：一种油菜根系分泌物田间原位收集方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410239303.2

专利申请（专利权）人：湖北茂盛生物有限公司
权利人地址：湖北省随州市随县厉山镇勤劳社区居委会六组

专利发明（设计）人：周义新,段贤杰,石磊,李伟,张世柏,周灿,焦义能,邱鸿栓,王涛,刘媛媛

专利摘要：本发明涉及土壤及植物科学技术领域，具体涉及一种油菜根系分泌物田间原位收集方法；S1、在试验田块中选定油菜播种位置，进行打根板，S2、在土体中放置多孔板，S3、播种：在平行于多孔板上沿15cm处播种油菜种子，在4～5片真叶时定苗至4株，间距7cm～9cm，S4、对根际土、非根际土和根系原位的根系分泌物进行收集，S5、收集根系分泌物。本发明通过土壤根系原位取样，收集油菜根系分泌物，提取酸性磷酸酶和有机酸并对二者的含量进行精确的分析与测定，该方法更具直观性、精确性、实用性和科学性，为田间条件下系统研究油菜根系分泌物提供重要手段，可为基于根系分泌物进行油菜磷高效品种的筛选提供科学依据和技术参考。

主权利要求：
1.一种油菜根系分泌物田间原位收集方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、在试验田块中选定油菜播种位置，进行打根板，选定的试验田块需尽量保持质地均匀且肥力均衡，且打根板位置应尽量靠近田埂一侧，当选定油菜播种位置后，以该位置为中心距离为15cm的一侧垂直向下打根板至30cm深，然后沿根板向外挖出一个30cm×30cm的垂直剖面，根板的尺寸为35cm×30cm；
S2、在土体中放置多孔板，包括以下步骤：
S21、在垂直剖面侧挖出一个与地面夹角43～47°的斜剖面；
S22、沿斜剖面放置多孔板，多孔板的尺寸为30cm×40cm，多孔板用固定卡槽和固定螺钉固定在不锈钢材料制成的边框上，且多孔板上表面紧挨土体；
S23、安装完成后，多孔板下侧将原土复原，并且在保证不损坏多孔板的前提下，尽量将土壤还填至原始密实度状态；
S3、播种：在平行于多孔板上沿15cm处播种油菜种子，在4～5片真叶时定苗至4株，间距
7cm～9cm；
S4、对根际土、非根际土和根系原位的根系分泌物进行收集，包括以下步骤：S41、在油菜苗期采用步骤S1和步骤S2中的方式挖出多孔板下侧的土壤，且土壤含水量在55％～65％时为佳；
S42、使用镊子小心剥离根系周围的土壤，避免穿出到多孔板下侧的油菜根系损伤，即非根际土，而紧密附着在根系表面的土壤即为根际土，并使用容器在原位连续收集24h内的根系分泌物；
S43、苗期收集完成后，将土体重新复原，后续可在油菜生长的越冬期、花期、角果期和成熟期再次原位收集根系分泌物；
S5、收集根系分泌物，包括以下步骤：
?1
S51、将步骤S4中的根系放入50mL的0.2mmol 的CaCl2浸提液中，浸提1～2min后取出，即为根际土的根系分泌物，称为根系分泌物一；
S52、将2.5～4.0g非根际土放入50mLCaCl2浸提液中浸提，即为非根际土的根系分泌物，称为根系分泌物二；
S53、在根系分泌物一和根系分泌物二中的浸提液中各加入0.12～0.18mL的含0.1％银离子和2.45％次氯酸钙的微生物抑制剂和有效成分大于85.0％的浓磷酸，所述微生物抑制剂为KatadynMF1T净水片；
S54、使用去离子水将根系表面的土壤和杂物冲洗干净；
?1
S55、将根系放入100mL的0.2mmol 的CaCl2浸提液中，并加入0.2～0.3mL的微生物抑制剂，避光收集24h后，即为根系分泌物三，并在根系分泌物三中加入0.12～0.18mL的浓磷酸；
S56、将收集到的浸提液放入?20℃冰箱中保存，浸提液中酸性磷酸酶活性用对硝基苯磷酸二钠做底物进行测定，使用高效液相色谱法测定根系分泌的小分子有机酸组分。
2.根据权利要求1所述的一种油菜根系分泌物田间原位收集方法，其特征在于，在步骤S22中，在放置多孔板时，将多孔板放入的角度误差控制在±2°，确保大多数根系可穿过多孔板。
3.根据权利要求2所述的一种油菜根系分泌物田间原位收集方法，其特征在于，在步骤S3中，油菜植物之间的距离需要尽量保持一致，且尽量保证不同处理间植株数一致，避免因植物种植密度不同对根系分泌物收集造成的影响。
4.根据权利要求3所述的一种油菜根系分泌物田间原位收集方法，其特征在于，在步骤S56中，测定根系分泌物中酸性磷酸酶活性时，因收集的酸性磷酸酶在外界环境条件下易分解，测定时长控制在24h以内。 说明书 : 一种油菜根系分泌物田间原位收集方法技术领域[0001] 本发明涉及土壤及植物科学技术领域，具体涉及一种油菜根系分泌物田间原位收集方法。背景技术[0002] 根系分泌物是植物生长期间，根系向生长介质分泌的所有化学物质的总称，是活化根际微域环境的关键因素，植物生长过程中，根系分泌物在土壤结构形成、养分转化和吸收、土壤微生物分布和缓解环境胁迫等方面具有重要作用。[0003] 油菜是我国主要油料作物之一，油菜需磷较多，对缺磷敏感，我国油菜主产区土壤缺磷是油菜产量增长的主要限制因素，油菜根系可通过根系分泌物特别是有机酸和酸性磷酸酶活化土壤中的难溶性磷，缓解低磷胁迫，油菜根系分泌的酸性磷酸酶可通过酶促反应促使有机磷化合物的酯磷键发生水解释放出醇和无机磷，进而提高土壤有机磷的生物有效性；油菜根系分泌的小分子有机酸可通过与磷酸根竞争络合位点、改变吸附剂表面电荷和酸化溶解等作用促使土壤表面的难溶性磷发生溶解释放，促进根系对土壤磷的吸收和利用；因此，建立油菜根系分泌物田间原位连续收集方法对研究田间磷素缺乏环境中油菜根系分泌物的种类、含量及活性非常关键，可为基于根系分泌物进行油菜磷高效品种的筛选提供科学依据和技术参考，具有重要意义。[0004] 目前，油菜根系分泌物的收集方法主要包括以下几种：[0005] 1、营养液培养收集：利用营养液培养收集油菜根系分泌物操作简单、方便、易于进行进一步分析，但是该体系下植物根系发育受限，与土壤中根系生长的微生态环境存在较大差异，根系分泌物的种类和含量均有别于田间实际环境，无法真实反映田间条件下油菜根系分泌物实际状况；[0006] 2、琼脂培养收集：以琼脂为培养基质收集油菜根系分泌物，该体系操作简单，感染率低，系统稳定率较高，可较完整收集根系分泌物，但是琼脂环境无法真实模拟土壤环境的异质性特性，不能激发油菜根系发生发育的潜力；[0007] 3、基质培养收集：以石英砂为主要培养基质进行油菜根系分泌物收集，该条件下油菜生长状况优于营养液培养，根系分泌物收集量较多，但石英砂的物理特性、机械强度、微生态环境只能部分反映油菜田间条件下根系分泌物的状况；[0008] 4、土壤盆栽培养收集：以土壤为基质进行油菜根系培养并收集根系分泌物，虽较接近田间土壤条件，但是仍无法代表和完全模拟油菜田间根系实际生长状况。[0009] 综上所述，研发一种油菜根系分泌物田间原位收集方法，仍是土壤及植物科学技术领域中急需解决的关键问题。发明内容[0010] 针对现有技术所存在的问题，本发明的目的在于提供一种油菜根系分泌物田间原位收集方法，本发明通过土壤根系原位取样，收集油菜根系分泌物，提取酸性磷酸酶和有机酸并对二者的含量进行精确的分析与测定，该方法更具直观性、精确性、实用性和科学性，为田间条件下系统研究油菜根系分泌物提供重要手段，可为基于根系分泌物进行油菜磷高效品种的筛选提供科学依据和技术参考。[0011] 为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：[0012] 一种油菜根系分泌物田间原位收集方法，包括以下步骤：[0013] S1、在试验田块中选定油菜播种位置，进行打根板；[0014] S2、在土体中放置多孔板；[0015] S3、播种：在平行于多孔板上沿15cm处播种油菜种子，在4～5片真叶时定苗至4株，间距7cm～9cm；[0016] S4、对根际土、非根际土和根系原位的根系分泌物进行收集；[0017] S5、收集根系分泌物。[0018] 本发明进一步设置为：在步骤S1中，选定的试验田块需尽量保持质地均匀且肥力均衡，且打根板位置应尽量靠近田埂一侧，当选定油菜播种位置后，以该位置为中心距离为15cm的一侧垂直向下打根板至30cm深，然后沿根板向外挖出一个30cm×30cm的垂直剖面，根板的尺寸为35cm×30cm。[0019] 本发明进一步设置为：在步骤S2中，所述在土体中放置多孔板，包括以下步骤：[0020] S21、在垂直剖面侧挖出一个与地面夹角43～47°的斜剖面；[0021] S22、沿斜剖面放置多孔板，多孔板的尺寸为30cm×40cm，多孔板用固定卡槽和固定螺钉固定在不锈钢材料制成的边框上，且多孔板上表面紧挨土体；[0022] S23、安装完成后，多孔板下侧将原土复原，并且在保证不损坏多孔板的前提下，尽量将土壤还填至原始密实度状态。[0023] 本发明进一步设置为：在步骤S22中，在放置多孔板时，将多孔板放入的角度误差控制在±2°，确保大多数根系可穿过多孔板。[0024] 本发明进一步设置为：在步骤S3中，油菜植物之间的距离需要尽量保持一致，且尽量保证不同处理间植株数一致，避免因植物种植密度不同对根系分泌物收集造成的影响。[0025] 本发明进一步设置为：在步骤S4中，所述对根际土、非根际土和根系原位的根系分泌物进行收集，包括以下步骤：[0026] S41、在油菜苗期采用步骤S1和步骤S2中的方式挖出多孔板下侧的土壤，且土壤含水量在55％～65％时为佳；[0027] S42、使用镊子小心剥离根系周围的土壤，避免穿出到多孔板下侧的油菜根系损伤，即非根际土，而紧密附着在根系表面的土壤即为根际土，并使用容器在原位连续收集24h内的根系分泌物；[0028] S43、苗期收集完成后，将土体重新复原，后续可在油菜生长的越冬期、花期、角果期和成熟期再次原位收集根系分泌物。[0029] 本发明进一步设置为：在步骤S5中，所述收集根系分泌物，包括以下步骤：[0030] S51、将步骤S4中的根系放入50mL的0.2mmol?1的CaCl2浸提液中，浸提1～2min后取出，即为根系分泌物一(根际土)；[0031] S52、将2.5～4.0g非根际土放入50mLCaCl2浸提液中浸提，即为根系分泌物二(非根际土)；[0032] S53、在根系分泌物一和根系分泌物二中的浸提液中各加入0.12～0.18mL的含0.1％银离子和2.45％次氯酸钙的微生物抑制剂(KatadynMF1T净水片)和有效成分大于85.0％的浓磷酸；[0033] S54、使用去离子水将根系表面的土壤和杂物冲洗干净；[0034] S55、将根系放入100mL的0.2mmol?1的CaCl2浸提液中，并加入0.2～0.3mL的微生物抑制剂，避光收集24h后，即为根系分泌物三(根系分泌物)，并在根系分泌物三中加入0.12～0.18mL的浓磷酸；[0035] S56、将收集到的浸提液放入?20℃冰箱中保存，浸提液中酸性磷酸酶活性用对硝基苯磷酸二钠做底物进行测定，使用高效液相色谱法测定根系分泌的小分子有机酸组分。[0036] 本发明进一步设置为：在步骤S56中，测定根系分泌物中酸性磷酸酶活性时，因收集的酸性磷酸酶在外界环境条件下易分解，测定时长控制在24h以内。[0037] 有益效果[0038] 采用本发明提供的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下[0039] 有益效果：[0040] (1)本发明中，通过土壤根系原位取样，收集油菜根系分泌物，提取酸性磷酸酶和有机酸并对二者的含量进行精确的分析与测定，该方法较其他培养及收集方法，更具直观性、精确性、实用性和科学性，同时本发明利用田间根系分泌物原位收集技术，对油菜根系酸性磷酸酶和有机酸进行科学收集，为田间条件下系统研究油菜根系分泌物提供重要的手段，可为基于根系分泌物进行油菜磷高效品种的筛选提供科学依据和技术参考，具有重要意义。[0041] (2)本发明中，通过田间原位收集油菜根系分泌物的方法，主要包括打根板、放置多孔板、播种、对根际土、非根际土和根系原位的根系分泌物进行收集、收集根系分泌物，通过在土体中放置多孔板，使油菜根系可以向下穿过多孔板生长，便于根系分泌物的原位收集，同时防止原位提取根系分泌物时土壤挖掘导致土体不稳。附图说明[0042] 图1为一种油菜根系分泌物田间原位收集方法的方法流程图；[0043] 图2为一种油菜根系分泌物田间原位收集方法的油菜田间生长示意图；[0044] 图3为一种油菜根系分泌物田间原位收集方法的油菜田间分布图；[0045] 图4为一种油菜根系分泌物田间原位收集方法的根系分泌物收集示意图；[0046] 图5为一种油菜根系分泌物田间原位收集方法的多孔板示意图；[0047] 图6为一种油菜根系分泌物田间原位收集方法的根板示意图；[0048] 图7为一种油菜根系分泌物田间原位收集方法的固定卡槽和固定螺钉示意图；[0049] 图8为一种油菜根系分泌物田间原位收集方法的收集根系分泌物的容器示意图；[0050] 图9为一种油菜根系分泌物田间原位收集方法的油菜根系分泌物在磷充足条件下根际土壤中有机酸含量图；[0051] 图10为一种油菜根系分泌物田间原位收集方法的油菜根系分泌物在磷充足条件下非根际土壤中有机酸含量图；[0052] 图11为一种油菜根系分泌物田间原位收集方法的油菜根系分泌物在磷缺乏条件下根际土壤中有机酸含量图；[0053] 图12为一种油菜根系分泌物田间原位收集方法的油菜根系分泌物在磷缺乏条件下非根际土壤中有机酸含量图；[0054] 图13为一种油菜根系分泌物田间原位收集方法的油菜根系分泌物的根际土壤和非根际土壤中酸性磷酸酶活性图。具体实施方式[0055] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0056] 下面结合实施例对本发明做进一步的描述。[0057] 实施例，请参照图1－图13所示，一种油菜根系分泌物田间原位收集方法，包括以下步骤：[0058] 步骤一、在试验田块中选定油菜播种位置，进行打根板；[0059] 其中，选定的试验田块需尽量保持质地均匀且肥力均衡，且打根板位置应尽量靠近田埂一侧，当选定油菜播种位置后，以该位置为中心距离为15cm的一侧垂直向下打根板至30cm深，然后沿根板向外挖出一个30cm×30cm的垂直剖面，根板为304不锈钢材料，且根板的尺寸为35cm×30cm，根板示意图，如图6所示。[0060] 步骤二、在土体中放置多孔板，包括以下步骤：[0061] S21、在垂直剖面侧挖出一个与地面夹角43～47°的斜剖面；[0062] S22、沿斜剖面放置多孔板，多孔板示意图，如图5所示，多孔板的尺寸为30cm×40cm，多孔板用固定卡槽和固定螺钉固定在不锈钢材料制成的边框上，固定卡槽可为不锈钢材料，且多孔板上表面紧挨土体，固定卡槽和固定螺钉示意图，如图7所示；[0063] 其中，多孔板可以为聚氯乙烯材料，在放置多孔板时，将多孔板放入的角度误差控制在±2°，确保大多数根系可穿过多孔板；[0064] S23、安装完成后，多孔板下侧将原土复原，并且在保证不损坏多孔板的前提下，尽量将土壤还填至原始密实度状态。[0065] 步骤三、播种：在平行于多孔板上沿15cm处播种油菜种子，在4～5片真叶时定苗至4株，间距7cm～9cm，油菜田间分布图，如图3所示；[0066] 其中，油菜植物之间的距离需要尽量保持一致，且尽量保证不同处理间植株数一致，避免因植物种植密度不同对根系分泌物收集造成的影响。[0067] 步骤四、对根际土、非根际土和根系原位的根系分泌物进行收集，包括以下步骤：[0068] S41、在油菜苗期采用步骤S1和步骤S2中的方式挖出多孔板下侧的土壤，且土壤含水量在55％～65％时为佳；[0069] S42、使用镊子小心剥离根系周围的土壤，避免穿出到多孔板下侧的油菜根系损伤，即非根际土，而紧密附着在根系表面的土壤即为根际土，并使用容器在原位连续收集24h内的根系分泌物，容器示意图，如图8所示；[0070] S43、苗期收集完成后，将土体重新复原，后续可在油菜生长的越冬期、花期、角果期和成熟期再次原位收集根系分泌物。[0071] 步骤五、收集根系分泌物，包括以下步骤：[0072] S51、将步骤S4中的根系放入50mL的0.2mmol?1的CaCl2浸提液中，浸提1～2min后取出，即为根系分泌物一(根际土)；[0073] S52、将2.5～4.0g非根际土放入50mLCaCl2浸提液中浸提，即为根系分泌物二(非根际土)；[0074] S53、在根系分泌物一和根系分泌物二中的浸提液中各加入0.12～0.18mL的含0.1％银离子和2.45％次氯酸钙的微生物抑制剂(KatadynMF1T净水片)和有效成分大于85.0％的浓磷酸，以抑制提取液中微生物活性及其对有机酸的转化和利用；[0075] S54、使用去离子水将根系表面的土壤和杂物冲洗干净；[0076] S55、将根系放入100mL的0.2mmol?1的CaCl2浸提液中，并加入0.2～0.3mL的微生物抑制剂，避光收集24h后，即为根系分泌物三(根系分泌物)，并在根系分泌物三中加入0.12～0.18mL的浓磷酸；[0077] S56、将收集到的浸提液放入?20℃冰箱中保存，浸提液中酸性磷酸酶活性用对硝基苯磷酸二钠做底物进行测定，使用高效液相色谱法测定根系分泌的小分子有机酸组分；[0078] 其中，测定根系分泌物中酸性磷酸酶活性时，因收集的酸性磷酸酶在外界环境条件下易分解，测定时长控制在24h以内。[0079] 根系分泌物试验[0080] 实验条件：土壤性质为黄棕壤，试验设置正常磷和缺磷处理，其中，正常磷处理磷?1 ?1肥施用量为90kgP2O5ha ，缺磷处理磷肥施用量为30kgP2O5ha ；[0081] 实验过程：分别在油菜生长的苗期、越冬期、花期、角果期和成熟期收集根际和非根际土壤中的根系分泌物，包括小分子有机酸(酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸等)和酸性磷酸酶，并测定根系分泌物中酸性磷酸酶活性，实验数据结果如图9－图13所示(包括根系分泌物一和根系分泌物二中的根系分泌物的测试数据)；[0082] 由上述试验结果可知：磷充足和磷缺乏处理下，油菜根系分泌物在根际土壤和非根际土壤中小分子有机酸含量(图9－图12)和酸性磷酸酶活性(图13)；缺磷可显著诱导根系分泌小分子有机酸增加和酸性磷酸酶活性增加，油菜主要分泌柠檬酸、苹果酸和琥珀酸，且在油菜生长的花期根系分泌有机酸含量最多。[0083] 本发明中，采用该油菜根系分泌物田间原位收集方法，在对油菜田间原位根系分泌物进行收集时，需要在同一生育期内对各个处理分别进行田间取样；首先选定的试验田块需尽量保持质地均匀且肥力均衡，为了便于在田块中安装多孔板装置，需要在试验田块中选定油菜播种位置，并在靠近田埂一侧，以该位置为中心距离为15cm的一侧垂直向下打根板至30cm深，以防扰动土壤表面，沿根板向外挖出一个30cm×30cm的垂直剖面；然后，为防止原位提取根系分泌物时土壤挖掘导致土体不稳，在土体中放置多孔板，使油菜根系可以向下穿过多孔板生长，便于根系分泌物的原位收集；其次进行播种，在平行于多孔板上沿15cm处播种油菜种子，在4～5片真叶时定苗至4株，间距约为7～9cm，以使较多根系穿过多孔板；接下来可以对根际土、非根际土和根系原位的根系分泌物进行收集；最后收集根系分泌物；[0084] 本发明基于南方油菜田间土壤种植环境，通过土壤根系原位取样，收集油菜根系分泌物(油菜田间条件下原位收集的根系分泌物主要包括酸性磷酸酶和有机酸)，提取酸性磷酸酶和有机酸并对二者的含量进行精确的分析与测定，因田间条件下油菜根际微域环境更加复杂多变，因此，该方法较其他培养及收集方法，更具直观性、精确性、实用性和科学性；同时本发明利用田间根系分泌物原位收集技术，对油菜根系酸性磷酸酶和有机酸进行科学收集(田间原位条件下准确收集油菜根系分泌物对于研究养分胁迫下油菜根系分泌物的种类、含量及活性非常关键)，为田间条件下系统研究油菜根系分泌物提供重要的手段，可为基于根系分泌物进行油菜磷高效品种的筛选提供科学依据和技术参考，具有重要意义。[0085] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不会使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

专利地区：湖北

专利申请日期：2024-03-04

专利公开日期：2024-09-24

专利公告号：2024-09-24