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专利名称：一种猕猴桃AcVB病毒的多克隆抗体及其制备方法和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202211378036.4

专利申请（专利权）人：四川农业大学
权利人地址：四川省雅安市雨城区新康路46号

专利发明（设计）人：尚静,高杨远著,冯鸿萍,曾秋霞,王雪婷,李燕

专利摘要：本发明提供了一种猕猴桃AcVB病毒的多克隆抗体及其制备方法和应用，该AcVB病毒的多克隆抗体的制备方法主要是采用相关引物扩增出AcVB?CP基因片段，然后将AcVB?CP基因片段连接到表达载体上，然后对其进行表达，获得重组蛋白，然后采用该重组蛋白免疫大白兔，制备抗体。将该抗体制备成检测试剂盒或者检测试纸等产品，可准确、方便、灵敏、快捷、经济地检测出猕猴桃的患病情况，适合于对大量样本的检测。

主权利要求：
1.一种猕猴桃AcVB外壳蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）获取患AcVB病猕猴桃总RNA；
（2）以总RNA为模板，采用AcVB?F2/R2引物扩增猕猴桃AcVB外壳蛋白基因的全基因片段，然后以猕猴桃AcVB外壳蛋白全基因片段为模板，采用AcVB?F3/R3引物扩增猕猴桃AcVB外壳蛋白目标基因片段；其中，AcVB?F2/R2引物的核苷酸序列分别如下所示：AcVB?F2引物为：5’?GTTATGCCAAACGTTTATGATGC?3’，AcVB?R2引物为：5’?TAGAGCGTCTCACTATCAGTTACTC?
3’；AcVB?F3/R3引物的核苷酸序列分别如下所示：AcVB?F3引物为：5’?ATGTCAGGAGCTACATCAAGG?3’，AcVB?R3引物为：5’?CTATATCTCAACAGCTTGTTCGC?3’；
（3）将猕猴桃AcVB外壳蛋白目标基因片段连接到表达载体上，获得重组载体，然后将重组载体转化大肠杆菌，诱导蛋白表达和纯化，得到重组蛋白；
（4）以重组蛋白免疫大白兔，制备获得猕猴桃AcVB外壳蛋白的多克隆抗体。
2.如权利要求1所述的猕猴桃AcVB外壳蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中猕猴桃总RNA的获取方法如下：采用500μLRNA提取缓冲液I、500μLRNA提取缓冲液II和100μL无水乙醇，在液氮中研磨0.2g猕猴桃叶，提取总RNA，总RNA用4mol/LLiCl在?20°C下沉淀过夜，第二天，用70%的乙醇纯化RNA，制得；其中所述RNA提取缓冲液I由体积比为25:24:1的水饱和苯酚、氯仿和异戊醇组成；所述RNA提取缓冲液II中含有质量浓度为
1%的SDS，浓度为20mmol/L的TrisBase，浓度为0.2mol/L的NaCl以及5mmol/LEDTA?Na2。
3.如权利要求1所述的猕猴桃AcVB外壳蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中猕猴桃AcVB外壳蛋白基因的全基因片段的长度为840个碱基对。
4.如权利要求1所述的猕猴桃AcVB外壳蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中采用AcVB?F2/R2引物扩增猕猴桃AcVB外壳蛋白基因的全基因片段的PCR扩增条件为：扩增体系包括:12.5μL2×TaqMasterMix、1μLAcVB?F2、1μLAcVB?R2、1μL总RNA和9.5μLddH2O；
扩增程序为：94℃3min，94℃30s，54℃30s，72℃1min，34个循环，72℃10min，12℃保存。
5.如权利要求1所述的猕猴桃AcVB外壳蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中猕猴桃AcVB外壳蛋白目标基因片段的长度为597个碱基对。
6.如权利要求1所述的猕猴桃AcVB外壳蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中采用AcVB?F3/R3引物扩增猕猴桃AcVB外壳蛋白目标基因片段的扩增条件为：扩增体系包括:12.5μL2×TaqMasterMix、1μLAcVB?F3、1μLAcVB?R3、1μL猕猴桃AcVB外壳蛋白全基因片段和9.5μLddH2O；
扩增程序为：94℃3min，94℃30s，48℃30s，72℃1min，34个循环，72℃10min，12℃保存。
7.权利要求1?6中任一项所述方法制备得到的猕猴桃AcVB外壳蛋白多克隆抗体。
8.权利要求7中所述的猕猴桃AcVB外壳蛋白多克隆抗体在制备猕猴桃AcVB病毒检测试剂、检测试剂盒或检测试纸中的应用。 说明书 : 一种猕猴桃AcVB病毒的多克隆抗体及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种猕猴桃AcVB病毒的多克隆抗体及其制备方法和应用。背景技术[0002] 猕猴桃是营养丰富的经济类水果，对人类健康有很大的益处。病毒是感染猕猴桃的重要微生物病原，降低猕猴桃产量、品质和经济效益，严重威胁猕猴桃产业的发展。[0003] 前人研究发现有10多种病毒可以感染猕猴桃，包括特异性病毒和非特异性病毒。AcVB是感染猕猴桃的特异性病毒。AcVB是正单链RNA病毒，具有5个开放阅读框(Openreadingframe，ORF)和一个多聚腺苷化的3’末端。其中，ORF4编码外壳蛋白(Coatprotein，CP)，是病毒基因相对最保守的区段。AcVB感染的中华猕猴桃主要表现褪绿斑，多见于开花前后的新芽基叶上，至初夏症状消退，有的藤蔓甚至直到初夏才出现症状。上述特征使AcVB难以通过症状判断，导致病毒在田间扩散和传播。RNA病毒变异频繁，致病力强，且缺少有效的防控手段，因此，急需研发简单易行的病毒病早期快速检测技术。[0004] 目前，AcVB的主要检测方法是利用病毒特异性引物，进行逆转录聚合酶链反应(RT?PCR)。这种方法通常具有较高的灵敏度，但存在耗时费力、仪器设备要求高、技术过于专业，田间难以操作的缺点。也有研究人员认为，基于核酸的高特异性，若病毒基因组突变，将导致假阴性结果。此外，猕猴桃叶片中的高多糖和多酚使得提取核酸变得困难。发明内容[0005] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种猕猴桃AcVB病毒的多克隆抗体的制备方法及应用，采用该抗体作为检测试剂可准确、快速地检测出猕猴桃果树是否被猕猴桃AcVB病毒侵染，以便提高猕猴桃的产量及品质。[0006] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：[0007] 一种猕猴桃AcVB外壳蛋白的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：[0008] (1)获取患病猕猴桃总RNA；[0009] (2)以总RNA为模板，采用AcVB?F2/R2引物扩增AcVB?CP基因的全基因片段，然后以AcVB?CP全基因片段为模板，采用AcVB?F3/R3引物继续扩增出AcVB?CP目标基因片段；[0010] (3)将AcVB?CP目标基因片段连接到表达载体上，获得重组载体，然后将重组载体转化大肠杆菌，诱导蛋白表达和纯化，得到重组蛋白；[0011] (4)以重组蛋白免疫大白兔，制备获得猕猴桃AcVB外壳蛋白的多克隆抗体。[0012] 进一步地，步骤(1)中猕猴桃总RNA的获取方法如下：采用500μLRNA提取缓冲液I、500μLRNA提取缓冲液II和100μL无水乙醇，在液氮中研磨0.2g猕猴桃叶，提取总RNA，总RNA用4mol/LLiCl在?20℃下沉淀过夜，第二天，用70％的乙醇纯化RNA，制得；其中所述RNA提取缓冲液I由体积比为25:24:1的水饱和苯酚、氯仿和异戊醇组成；所述RNA提取缓冲液II中含有质量浓度为1％的SDS，浓度为20mmol/L的TrisBase，浓度为0.2mol/L的NaCl以及5mmol/LEDTA?Na2。[0013] 进一步地，步骤(2)中AcVB?F2引物为：5’?GTTATGCCAAACGTTTATGATGC?3’，AcVB?R2引物为：5’?TAGAGCGTCTCACTATCAGTTACTC?3’。[0014] 进一步地，步骤(2)中包含AcVB?CP基因的基因片段的长度为840个碱基对。[0015] 进一步地，步骤(2)中包含AcVB?CP基因的基因片段的PCR扩增条件为：[0016] 扩增体系包括:12.5μL2×TaqMasterMix、1μLAcVB?F2、1μLAcVB?R2、1μL总RNA和9.5μLddH2O；[0017] 扩增程序为：94℃3min，94℃30s，54℃30s，72℃1min，34个循环，72℃10min，12℃保存。[0018] 进一步地，步骤(2)中AcVB?F3引物为：5’?ATGTCAGGAGCTACATCAAGG?3’，AcVB?R3引物为：5’?CTATATCTCAACAGCTTGTTCGC?3’。[0019] 进一步地，步骤(2)中AcVB?CP基因片段的长度为597个碱基对。[0020] 进一步地，步骤(2)扩增条件为：扩增体系包括:12.5μL2×TaqMasterMix、1μLAcVB?F3、1μLAcVB?R3、1μL总RNA和9.5μLddH2O；[0021] 扩增程序为：94℃3min，94℃30s，48℃30s，72℃1min，34个循环，72℃10min，12℃保存。[0022] 上述的猕猴桃AcVB外壳蛋白多克隆抗体在制备猕猴桃AcVB病毒检测试剂、检测试剂盒或检测试纸中的应用。[0023] 本发明所产生的有益效果为：[0024] 1、本发明中通过制备猕猴桃AcVB外壳蛋白多克隆抗体，将其应用于猕猴桃检测中，利用抗原抗体特异性识别的原理，可灵敏、快捷、经济地检测出猕猴桃的患病情况，适合于对大量样本的检测。该抗体可通过蛋白杂交、ELISA等多种血清学检测，也可通过装载，可制作检测试纸，结果判断直观，非专业人士易于掌握；且填补了猕猴桃病毒检测中多克隆抗体制备技术的空白。[0025] 2、本申请中的猕猴桃叶片提取方法利用RNA不溶于无水乙醇、多糖多酚溶于无水乙醇的特点进行研发，有效解决了现有的提取方法存在的无法获得高纯度RNA的问题。[0026] 3、本申请中的抗体制备过程中选择了相对保守的外壳蛋白基因的核心区段，保证抗体的通用性。[0027] 4、本申请中的方法优化了目的片段的PCR扩增的程序，尤其是超长时间的片段延长，降低扩增过程中错配概率，获得更准确的目的片段序列，为抗体的制备提供精准的模板。附图说明[0028] 图1为感染AcVB的猕猴桃叶片症状的实物照片；[0029] 图2为AcVB?CP基因进化树，A为基于核苷酸的进化树，B为基于氨基酸序列的进化树；[0030] 图3为基因克隆、重组载体构建和转化的结果图；A为AcVB?CP全基因(840bp)克隆产物的琼脂糖凝胶电泳图，B为AcVB?CP目标基因(597bp)克隆产物的琼脂糖凝胶电泳图，C为质粒酶切、质：湍勘昊蚱蔚那碇悄旱缬就迹籇为感受态细胞转化的琼脂糖凝胶结果图；[0031] 图4蛋白表达和纯化结果图，A为AcVB?CP蛋白的诱导表达的SDS?PAGE 检测图，B、C为SDS?PAGE检测蛋白纯化结果图；D为SDS?PAGE浓度效果图；[0032] 图5为蛋白杂交与ELISA结果图，A图中1、2、3泳道蛋白添加量分别为 0.2、1、5、μg，B为ELISA终止后每个反应孔的颜色，孔1和孔2为空白对照； 泳道3和泳道4为阳性对照；泳道5和泳道6是用1×PBS缓冲研磨的YA35样 品；泳道7和泳道8是用1×PBS缓冲研磨的QL17样品；泳道9和泳道10为 DJY33样品，使用1×PBS缓冲；泳道11和泳道12是含有AcVB的猕猴桃叶， 用1×PBS缓冲液研磨；[0033] 图6为ELISA法检测抗体效价的结果图，A为抗体和抗血清在不同稀释度 下的吸光度值，每次稀释时的抗体和抗血清(S)的吸光度值与空白对照BC(B).的 吸光度值的比值；[0034] 图7为YA12样本中AcVB?CP基因与其他已发表的AcVB?CP基因的比较 图；[0035] 图8为用于合成目的片段的14个正向引物列图。具体实施方式[0036] 下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。[0037] 1.材料与方法[0038] 1.1.材料[0039] 在四川省雅安、邛崃和都江堰地区采集疑似病毒病的猕猴桃叶片，所有样 品冰盒干燥暂存带回实验室，保存在?80℃的超低温冰箱中。所有叶片样品的叶 脉间出现不同程度的褪色斑点。此外，DJY33样品出现了叶片皱缩(图1)。[0040] 表1本研究中使用的所有引物[0041] Primers Sequences(5?3)AcVB?F1 GTTTGCGAGGAGACGTAGGGCAcVB?R1 AGTTAAGTGCTCTYGGRGGTGTGAcVB?F2 GTTATGCCAAACGTTTATGATGCAcVB?R2 TAGAGCGTCTCACTATCAGTTACTCAcVB?F3 ATGTCAGGAGCTACATCAAGGAcVB?R3 CTATATCTCAACAGCTTGTTCGC[0042] 1.2.RNA提取与AcVB?CP基因克隆[0043] 采用500μL RNA提取缓冲液I(水饱和苯酚、氯仿、异戊醇，v/v/v，25/24/1)， 500μL RNA提取缓冲液II(1％ SDS，20mmol/L Tris Base pH＝8.0，0.2mol/L NaCl，5mmol/L EDTA?Na2)和100μL无水乙醇，在液氮中研磨0.2g猕猴桃叶， 提取总RNA。RNA用4mol/L LiCl在?20℃下沉淀过夜。第二天，用70％的乙 醇纯化RNA。纯化后的RNA真空干燥，在ddH2O中溶解。[0044] 以总RNA为模板，用Golden star TM RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2试剂盒 (Tsignke，成都，中华人民共和国)按照说明书合成cDNA。采用AcVB?F1/R1引 物进行正常PCR检测，鉴定疑似感病样品是否携带AcVB。取雅安地区YA12 阳性样品进行后续实验。[0045] 根据NCBI数据库中已公布的AcVB序列设计引物。正常PCR扩增出包含 AcVB?CP基因的全长840个碱基对的片段，反应体系包括:12.5μL 2×Taq Master Mix(Vazyme，Nanjing，JS，PRC)、1μ、1μL总RNA和9.5μLddH2O。具体步骤如下：[0046] 表2PCR反应条件克隆长840bp的序列，包括597bp的AcVB?CP[0047][0048] PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳确认(图3?A)，其中1泳道、2泳道和3泳道分别表示三次重复实验的结果，三次重复实验证明结果一致，后经成都生工生物技术公司测序。根据上述测序结果设计引物AcVB?F3和AcVB?R3用于扩增AcVB?CP基因，除引物不同外，反应体系相同。产品经琼脂糖凝胶电泳确认后(图3?B)，其中1泳道、2泳道和3泳道分别表示三次重复实验的结果，三次重复实验证明结果一致，由成都生工生物技术有限公司进行测序。[0049] 表3克隆AcVB?CP的PCR反应条件(597bp)[0050][0051] 1.3.序列分析和进化树的构建[0052] 利用DNAMAN软件将本研究克隆的序列(AcVB?CP)与NCBI中公开的序列名称及登录号DJY2(MK900441)、DJY5(MK900446)、QL19(MK900452)、QL29(MK900454)、QL33(MK900443)和AcVB全基因组CP部分(NC016404)进行比较(图7)。将这7个序列及其推测的氨基酸序列用MEGA软件构建进化树。[0053] 将本研究克隆的AcVB?CP基因与NCBI上获得的DJY2、DJY5、QL19、QL29、QL33基因和AcVB全基因组CP部分NC016404.1进行比较(图7)。基因同源率为91.46％，证明本方案克隆的AcVB的序列可用于后续抗体的制作。[0054] 利用上述基因构建进化树的结果显示，样本YA12、DJY5和QL29中的CP基因在同一组(组I)，其中AcVB?CP基因是一个独立的分支，可以证明上述三个基因具有密切的亲缘关系(图2?A)。[0055] 利用上述基因推导出的氨基酸序列，构建进化树的结果显示，样本YA12、DJY5和QL29中的CP基因处于同一类群(类群2)，也是同一分支，可以证明上 述三条序列遗传进化的亲缘关系较近(图2?B)。[0056] 1.4.序列的优化与合成[0057] 将AcVB?CP基因提供给杭州华生物完成密码子的优化，最终得到优化后的AcVB?CP'序列(相当于cDNA)。根据AcVB?CP'序列设计引物AcVB?CP 1～14(图 8)，PCR合成AcVB?CP片段。第一个PCR反应体系包括：0.5μL AcVB?CP 1～14(50pmol/uL/引物)、0.5μL PV2 DNA聚合酶(中华人民共和国，杭州，ZJ)、 10μL 5×PV2缓冲液、1μL 10mmol/L dNTP和ddH2O(最高50μL)。第二套PCR 反应体系包括：第一次PCR产物0.5μL，AcVB?CP1和AcVB?CP14的混合物 1μL(0.5uL/引物)，PV2 DNA聚合酶0.5μL，5×PV2缓冲液10μL，10mmol/L dNTP和ddH2O1μL，最高达50μL。具体步骤如下：[0058] 表4第一次和第二次PCR合成AcVB?CP片段的条件[0059][0060] 1.5.构建pET?28a?AcVB?CP表达载体[0061] 对1.4第二次PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳。按照DP214?03 DNA纯化 试剂盒(天根，北京，中华人民共和国)说明书进行回收。回收的产物和1010S BamH I，1094A Xho I(Takara，北京，中华人民共和国)消化的B540183?0001 pET?28a载体(生工，成都，中华人民共和国)用6022DNA连接试剂盒(TaKaRa， 北京，中华人民共和国)在16℃下连接90分钟。按说明书将连接产物pET?28a?AcVB?CP载体转化为CB108 Rosetta(DE3)感受态细胞(天根，北京，中 华人民共和国)，培养物转入含100μg/mL卡那霉素(Kana)的固体Luria?Bertani (LB)中，37℃孵育过夜。选择单菌落进行细菌PCR，用DP103?03 Mini质粒试剂 盒(天根，北京，中华人民共和国)从匹配良好的菌落中提取质粒。随后，成都生 工生物技术公司对质粒进行测序。测序结果在NCBI网站进行比对。[0062] 1.6.小剂量表达试验[0063] 将含pET?28a?AcVB?CP表达载体的大肠杆菌Rosetta(DE3)50μL置于含250 μg Kana的LB液5mL中，37℃，180rpm孵育过夜。对照组无异丙基?β?d?硫 代半乳糖苷(IPTG)，实验组IPTG为1mmol/L，两组均在37℃处理4h。处理后， 菌液4℃12000rpm离心10min，丢弃上清，用P2262裂解液(Beyotime，上海，中华人民共和国)裂解大肠杆菌。加入P0015L 5×Loading Buffer(Beyotime，上海， 中华人民共和国)25μL，煮沸10min，取10μL样品进行SDS?PAGE分析。[0064] 1.7.大量诱导表达[0065] 取3mL菌液转入含1.5mg Kana的300mL LB液中，进行质量诱导表达。 将诱导后的菌液10000rpm离心10min，收集菌体。用0.01mol/LPBS(pH＝7.4)10mL重悬，100W冰水浴中超声16min。4℃离心，12000rpm，10min，用10mL8mol/L尿素溶液重悬，100W冰水浴超声10min，保留20μL样品用于SDS?PAGE分析。[0066] 1.8.重组蛋白的纯化和验证[0067] 1.7中制备的样品，经Ni?NTA色谱柱(华，杭州，ZJ，中华人民共和国)在室温下以约1ml/min的速度纯化。用洗脱缓冲液(8mol/L尿素、250mmol/LNaCl、250mmol/L咪唑0.01mol/LPBS)洗脱蛋白质。将洗脱液放入透析袋中，使用透析缓冲液(4mol/L尿素、5％TM甘油、1％L?精氨酸、2％甘氨酸，0.01mol/LPBS)透析2h。使用Pierce ProteinConcentratorTube(Thermo，上海，中华人民共和国)浓缩蛋白样品，并通过SDS?PAGE验证。[0068] 上述试验结果显示如下：将pET?28a载体分别用BamHI和XhoI酶切，电泳验证酶切效果。如图3?C所示，酶切前的载体(泳道1)在电场作用下的运动速度比酶切后的载体(泳道2)要快。合成的目的基因(泳道3)被证明具有较高的浓度和正确的片段大小。综上所述，证明质粒酶切和基因克隆的操作是准确的(图3?C)。连接产物转入Rosetta(DE3)菌株。同时，采用载体特异性引物进行PCR，并通过电泳验证转化效果(图3?D)。[0069] 将转入重组质粒的Rosetta(DE3)菌株在37℃下培养，在37℃、4h诱导表达CP蛋白。在考马斯亮蓝染色SDS?PAGE凝胶上，可以观察到单个分子量约为25kDa的条带(泳道2)，而非iptg诱导的菌株(泳道1)没有相同分子量的条带，说明导入完成(图4?A)。[0070] 对于目的蛋白的纯化部分，SDS?PAGE结果显示超声粉碎菌液(泳道1)中有相当数量的目的蛋白，添加样品(泳道2)后几乎没有目的蛋白流出柱，从吸附柱洗脱的液体中含有大量的目的蛋白(泳道3，4)(图4?B)。对最终透析(图4?C)和浓缩(图4?D)的蛋白质样品进行SDS?PAGE检测，只有分子量25kDa的单条带，证明蛋白质纯化和回收操作完成。[0071] 1.9.抗血清的制备[0072] 重组蛋白与完全弗氏佐剂按1:1的体积比混合。并用这种混合物来免疫新西兰大白兔。免疫方式为多点皮下注射，每点0.1mL。第一次免疫时，抗原浓度为1mg/mL，每只兔0.5mL。重组蛋白与不完全弗氏佐剂按1:1的体积比在第2次和第4次免疫时混合，总注射量减半。[0073] 第1次免疫后第14天进行第2次免疫，第2次免疫与第3次免疫间隔7天。第三次免疫后第7天从兔耳中动脉取少量血清；如果试验结果合格，则在试验7天后进行第四次免疫，在第四次免疫完成7天后采集全血。[0074] 血液置于37℃水浴中，25分钟后取出。然后，血液样本被放置在室温下，让血液冷却。之后，样本被转移到4℃的冰箱中，等待血液自动分层。将上清液在12000rpm下离心2min，离心后将上清液转移到另一离心管中，注入10％硫柳汞钠溶液，最终浓度为0.02％。将溶液充分混合，置于?20℃保存。[0075] 1.10.抗血清的验证[0076] 重组蛋白经SDS?PAGE电泳，每道分别加入5μg、1μg和0.2μg。电泳程序分别为80V30min和120V90min，电泳后通过电泳转移细胞将蛋白转移到PVDF膜上。在此之后，膜在封闭缓冲液(5％脱脂牛奶溶液，1％TBST)中室温旋转3小时。[0077] 取抗血清AcVB?CP20μL，按1:500稀释的比例加入封闭缓冲液中，与抗血清置于封闭缓冲液中，4℃旋转培养12h。之后，用1％TBST洗涤3次，每次10分钟。酶标山羊抗兔IgG(生工，成都，中华人民共和国)1μL，用封闭缓冲液按1:2万稀释，室温旋转孵育2小时。之后，用1％TBST，E412?01ECL发光试剂(Vazyme，Nanjing，JS，PRC)按说明书洗涤膜3次，每次10分钟，对膜进行拍照。[0078] ELISA法验证抗血清对田间携带AcVB样品的效价。取0.2g猕猴桃叶，加入1mL0.01mol/LPBS(pH＝7.4)，液氮研磨10min，4℃，12000rpm离心取上清。在514201polystyreneELISA平板(NEST，无锡，中华人民共和国)反应孔中分别加入上清液100μL、含0.4μg重组蛋白0.01mol/LPBS100μL(正对照)、0.01mol/L感染猕猴桃A病毒(AcVA)的叶片PBS研磨液100μL(负对照)、0.01mol/L健康猕猴桃叶片的PBS研磨液100μL(空白对照)。所有反应重复进行，平板放置在4℃。[0079] 12h后，弃去所有反应孔中的溶液，以180μL，1％TBST/孔冲洗所有反应孔。每孔加入60μL封闭缓冲液，37℃孵育2小时。丢弃封闭缓冲液，在封闭缓冲液中加入AcVB?CP抗血清50μL，1:2000稀释。将抗血清溶液加入反应孔中，37℃孵育1小时。弃去抗血清溶液，每个反应孔中加入1％TBST180μL洗涤。取酶标山羊抗兔IgG溶液100μL(1:500稀释度)加入反应孔，37℃孵育45min，弃二抗溶液，用1％TBST180μL洗涤3次。避光条件下，在每个反应孔中加入100μL临时配制的P0209TMB显色液(Beyotime，上海，中华人民共和国)。37℃，反应5min后，每个反应孔加入90μL2mol/L硫酸终止反应。反应结束后ELISA平板置于预热过的酶标仪(450nm)中读。舛戎滴瞻锥哉湛椎2倍，可认为发生阳性反应。[0080] 蛋白杂交结果表明，在3个条带上存在明显的单条带，分子量约为25kDa。值得注意的是，在0.2μg蛋白的泳道(泳道1)中也出现了清晰的条带(图5?A)。综上所述，可以证明在Rosetta(DE3)中表达的CP可以被抗血清敏感的识别。[0081] 加入硫酸终止ELISA反应后，阳性对照和待测样品的反应孔内液体变黄。初步确定发生了阳性反应(图5?B)。板(空板的每个反应孔的吸光度已经在450nm下预先确定)被放置在预热的微板阅读器中。在450nm处测定吸光度。[0082] 表5在450nm下的吸光度值和数据处理结果。[0083][0084] 注：示例缩写为S，空白对照缩写为B[0085] 从表5的数据可以看出，空白对照(BC)和阴性对照(NC)的吸光度处于非常低的水平，阳性对照(PC)的吸光度最高。OD450(NC)/OD450(BC)小于2，可认为是阴性反应；而OD450(S)/OD450(BC)的值大于2，可认为是阳性反应。因此，所制备的抗血清只能检测田间猕猴桃叶片携带的AcVB病毒，而不能识别其他植物病毒。以上结果证明抗血清具有较高的敏感性和特异性。[0086] 1.11.抗血清的进一步纯化和效价检测[0087] 抗血清经0.45μm微孔膜过滤，蛋白a/G琼脂糖柱进一步纯化。以抗血清为对照，探讨抗体的效力。纯化后的重组蛋白作为抗原，用CBS缓冲液(0.05mol/L，pH＝9.6)稀释至1μg/mL。抗体和抗血清分别用1％BSAE661003在1％TBST中按1:250、1:1000、1:4000、1:16000、1:64000、1:256000、1:1024000稀释。所有反应都是重复的。采用相同的阳性反应标准，用ELISA法检测纯化效果和抗体效价。[0088] 用1％BSA溶液在1％TBST中按1:250、1:1000、1:4000、1:16000、1:64000、1:256000、1:1024000的比例稀释纯化的抗体和抗血清。用同样的方法进行ELISA，读取450nm处的吸光度值。吸光度值的结果如图6?A所示；在每次稀释时，BC的平均吸光度值与平均吸光度值的比值如图6?B所示。[0089] OD450(抗血清)/OD450(BC)在1:1024000稀释时为5.8，可认为是阳性反应。在相同稀释度下，OD450(抗体)/OD450(BC)为10.2，可认为是阳性反应，说明纯化后的抗体在稀释倍数为1:1024000时仍能检测到重组蛋白。此外，纯化后的抗体在所有稀释浓度下都比纯化前的抗血清表现出更高的效力。结果表明，纯化的抗体具有较高的效力。

专利地区：四川

专利申请日期：2022-11-04

专利公开日期：2024-09-24

专利公告号：2024-09-24