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专利名称：六堡茶中儿茶素类物质和生物碱的定性方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210054767.7

专利申请（专利权）人：梧州市食品药品检验所
权利人地址：广西壮族自治区梧州市万秀区梧州西环路中段198号

专利发明（设计）人：罗达龙,王华,覃蓝,文俊萍,杨梓莹,黄琳,李夷君,刘虹虹,蒋德莉,柯立坚

专利摘要：本发明公开了六堡茶中儿茶素类物质和生物碱的定性方法，属于茶叶成分测定的技术领域，利用该测定方法能够准确测定六堡茶中是否含有儿茶素类物质和生物碱，该测定方法的抗干扰性较好、专属性强；包括如下步骤：(1)取儿茶素类物质和生物碱对照品经溶解稀释后得到对照品稀释液；(2)取对照品稀释液使用液相质谱联用仪测定，建立对比质谱图数据库；(3)取待测定六堡茶样品浸泡过滤，离心后取提取液，稀释过滤得待测定样品稀释液；(4)取待测定样品稀释液使用液相质谱联用仪测定得待测定样品图谱，将待测定样品与对比质谱图数据库中数据匹配后得到测定结果。

主权利要求：
1.一种六堡茶中儿茶素类物质和生物碱的定性方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取儿茶素类物质和生物碱对照品经溶解稀释后得到对照品稀释液；
(2)取步(1)所得对照品稀释液使用液相串联高分辨质谱测定，建立对比质谱图数据库；
(3)取待测定六堡茶样品浸泡过滤，离心后取提取液，稀释过滤得待测定样品稀释液；
(4)取步(3)所得待测定样品稀释液使用液相串联高分辨质谱测定得待测定样品图谱，将待测定样品与对比质谱图数据库中数据匹配后得到测定结果；
使用AgilentLC1290?6550?QTOF液相串联高分辨质谱进行测定，所述的步骤(2)和步骤(4)的测定包括液相色谱测定和质谱测定：所述液相色谱测定条件为：
色谱柱：C18色谱柱，3.0mm×150mm，2.7μm；进样量：3μL；柱温：30℃；流速：0.4mL/min；
流动相：A:0.1％甲酸水溶液，B：乙腈；流动相梯度：0～1min：2％B；1～5min：2％B→10％B；5～15min：10％B→30％B；15～20min：30％B→40％B；20～23min：40％B→50％B；23～25min：
50％B→60％B；25～27min：60％B→95％B；27～30min：95％B；30.01～35min：2％B；
所述质谱测定条件为：
干燥气温度：290℃；干燥器流速：11L/min；雾化器压力：45psi；鞘气温度：325℃；鞘气流速：8L/min；毛细管电压：3500V；喷嘴电压：250V；裂解电压380V；扫描模式为自动二级采集模式，正模式，扫描范围1级100～1000m/z，扫描范围2级50～500m/z，碰撞能量5～40V；
所述的步骤(4)中，测定结果包括是否含有儿茶素类物质和生物碱，所述的儿茶素类物质包括没食子酸、表没食子酸儿茶素、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯，所述的生物碱包括咖啡因、可可碱和茶碱。
2.根据权利要求1所述的六堡茶中儿茶素类物质和生物碱的定性方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，将儿茶素类物质和生物碱对照品经甲醇溶解稀释后制备得到10μg/mL的对照品稀释液。
3.根据权利要求1所述的六堡茶中儿茶素类物质和生物碱的定性方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，将所述的待测定六堡茶样品放入沸水中浸泡10min，加入六堡茶的质量与沸水体积的比为1:10g/mL浸泡后的液体放至室温后在4℃下离心15min，离心速度为9000r/min。 说明书 : 六堡茶中儿茶素类物质和生物碱的定性方法技术领域[0001] 本发明涉及茶叶成分测定的技术领域，更具体地说，尤其涉及六堡茶中儿茶素类物质和生物碱的定性方法。背景技术[0002] 六堡茶为黑茶的一种，在延缓衰老、抗菌、抗氧化方面有一定功效。六堡茶泡出的茶汤中富含儿茶素类物质，儿茶素类物质为黄烷醇的衍生物，其化合物为无色结晶形固体，该类物质能溶于水，其水溶液受热或在无机酸存在下，容易产生聚合形成无定形鞣质。儿茶素类物质和生物碱同属茶叶中的两大重要机能性成分。儿茶素类物质包括没食子酸、表没食子酸儿茶素、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯。[0003] 儿茶素类物质是天然的油脂抗氧化剂，抗氧化活性比维他命E高，并且可以清除人体产生的自由基，以保护细胞膜的作用，进而有延缓衰老的功效，其生物活性作用也受到了广泛的关注。六堡茶作为黑茶的功能成分，儿茶素类物质和生物碱在这些功效中发挥着至关重要的作用。一般会使用的液相方法测对该类物质作定性，这种测定方法需要使用标准物质对色谱峰保留时间进行定性，在茶叶复杂基质中分离目标峰与杂质峰难度较大。如没食子酸在液相测定中保留较差，测定中容易受到与其共流出的物质干扰，在对这些共流出物与目标物分离会耗费较长的时间，由于被测样品基质有一定区别，使用液相法时需先对被测样品进行一定预实验后，确定梯度方法才能正式开展检测。操作过程复杂，抗干扰性不好。因此，亟待发明一种能有效对六堡茶中儿茶素类物质和生物碱的定性方法，以测定出六堡茶中是否含有儿茶素类物质和生物碱。发明内容[0004] 本发明的目的在于提供六堡茶中儿茶素类物质和生物碱的定性方法，利用该测定方法能够准确测定六堡茶中是否含有儿茶素类物质和生物碱，该测定方法的抗干扰性较好、专属性强。[0005] 本发明的技术方案如下：[0006] 六堡茶中儿茶素类物质和生物碱的定性方法，包括如下步骤：[0007] (1)取儿茶素类物质和生物碱对照品经溶解稀释后得到对照品稀释液；[0008] (2)取步(1)所得对照品稀释液使用液相串联高分辨质谱测定，建立对比质谱图数据库；[0009] (3)取待测定六堡茶样品浸泡过滤，离心后取提取液，稀释过滤得待测定样品稀释液；[0010] (4)取步(3)所得待测定样品稀释液使用液相串联高分辨质谱测定得待测定样品图谱，将待测定样品与对比质谱图数据库中数据匹配后得到测定结果。进一步的，所述的步骤(1)中，将儿茶素类物质和生物碱对照品经甲醇溶解稀释后制备得到10μg/mL的对照品稀释液。[0011] 进一步的，所述的步骤(2)和步骤(4)的测定包括液相色谱测定和质谱测定：[0012] 所述液相色谱测定条件为：[0013] 色谱柱：C18色谱柱，3.0mm×150mm，2.7μm；进样量：3μL；柱温：30℃；流速：0.4mL/min；流动相：A:0.1％甲酸水溶液，B：乙腈；流动相梯度：0～1min：2％B；1～5min：2％B→10％B；5～15min：10％B→30％B；15～20min：30％B→40％B；20～23min：40％B→50％B；23～25min：50％B→60％B；25～27min：60％B→95％B；27～30min：95％B；30.01～35min：2％B；[0014] 所述质谱测定条件为：[0015] 干燥气温度：290℃；干燥器流速：11L/min；雾化器压力：45psi；鞘气温度：325℃；鞘气流速：8L/min；毛细管电压：3500V；喷嘴电压：250V；裂解电压380V；扫描模式为自动二级采集模式，正模式，扫描范围1级100～1000m/z，扫描范围2级50～500m/z，碰撞能量5～40V。[0016] 进一步的，所述的步骤(3)中，将所述的待测定六堡茶样品放入沸水中浸泡10min，加入六堡茶的质量与沸水体积的比为1:10g/mL，浸泡后的液体放至室温后在4℃下离心15min，离心速度为9000r/min。[0017] 进一步的，所述的步骤(4)中，测定结果包括是否含有儿茶素类物质和生物碱，所述的儿茶素类物质包括没食子酸、表没食子酸儿茶素、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯，所述的生物碱包括咖啡因、可可碱和茶碱。[0018] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：[0019] 本发明的六堡茶中儿茶素类物质和生物碱的定性方法，通过六堡茶对照品浸泡离心获得对照品稀释液，将对照品稀释液使用液相串联高分辨质谱测定，建立对比质谱图数据库，取待测定六堡茶样品浸泡离心获得待测定样品稀释液，将待测定样品稀释液使用液相串联高分辨质谱测定得待测定样品图谱，将待测定样品与对比质谱图数据库中数据匹配后得到测定结果。该定性方法使用高分辨质谱对六堡茶中的儿茶素类物质和生物碱；通过数据库匹配各物质一级质谱定性均达到90分以上，二级质谱定性均满足定性的4个鉴别点数来确定是否存在该种物质，该定性方法的专属性强。附图说明[0020] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：[0021] 图1是对比质谱图数据库中没食子酸二级质谱图；[0022] 图2是对比质谱图数据库中表没食子酸儿茶素二级质谱图；[0023] 图3是对比质谱图数据库中咖啡因二级质谱图；[0024] 图4是对比质谱图数据库中儿茶素二级质谱图；[0025] 图5是对比质谱图数据库中表儿茶素二级质谱图；[0026] 图6是对比质谱图数据库中表没食子儿茶素没食子酸酯二级质谱图；[0027] 图7是对比质谱图数据库中表儿茶素没食子酸酯二级质谱图；[0028] 图8是对比质谱图数据库中可可碱二级质谱图；[0029] 图9是对比质谱图数据库中茶碱二级质谱图。具体实施方式[0030] 下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。[0031] 本发明的六堡茶中儿茶素类物质和生物碱的定性方法，包括如下步骤：[0032] (1)取儿茶素类物质和生物碱对照品经甲醇溶解稀释后制备得到10μg/mL的对照品稀释液。其中，将待测定的六堡茶样品放入沸水中加盖浸泡10min，加入六堡茶的质量与沸水体积的比为1:10g/mL，重复浸泡5次，合并提取液，放至室温。将浸泡后的液体放至室温后在4℃下离心15min，离心速度为9000r/min。吸取提取液2mL到25mL容量瓶，用水稀释并定容至刻度，摇匀，使用0.2μm水相滤膜过滤得待测溶液。[0033] (2)取步(1)所得对照品稀释液与样品待测溶液使用液相串联高分辨质谱测定，使用对照品稀释液建立对比质谱图数据库对样品溶液所得色谱图进行匹配做定性检测。[0034] 其中，使用AgilentLC1290?6550?QTOF液相串联高分辨质谱进行测定，包括液相色谱测定和质谱测定：[0035] 液相色谱测定条件为：[0036] 色谱柱：C18色谱柱，3.0mm×150mm，2.7μm；进样量：3μL；柱温：30℃；流速：0.4mL/min；流动相：A:0.1％甲酸水溶液，B：乙腈；流动相梯度：0～1min：2％B；1～5min：2％B→10％B；5～15min：10％B→30％B；15～20min：30％B→40％B；20～23min：40％B→50％B；23～25min：50％B→60％B；25～27min：60％B→95％B；27～30min：95％B；30.01～35min：2％B；[0037] 所述质谱测定条件为：[0038] 干燥气温度：290℃；干燥器流速：11L/min；雾化器压力：45psi；鞘气温度：325℃；鞘气流速：8L/min；毛细管电压：3500V；喷嘴电压：250V；裂解电压380V；扫描模式为自动二级采集模式，正模式，扫描范围1级100～1000m/z，扫描范围2级50～500m/z，碰撞能量5～40V。[0039] 使用没食子酸、表没食子酸儿茶素、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、咖啡因、可可碱和茶碱对照品建立的对比质谱图数据库，该数据库包含各物质的名称、分子式、CAS号、保留时间、精确分子量、二级质谱图，如表1所示。[0040] 表1对比质谱图数据库包含内容[0041][0042] 对比质谱图数据库还包括各物质的一级质谱图和二级质谱图，其中，各物质的二级质谱图如下：[0043] (2.1)没食子酸二级质谱图。将对照品稀释液进行质谱测定时，碰撞能量分别为5V、10V、20V、30V、40V下所产生的没食子酸二级质谱图，如图1所示。[0044] (2.2)表没食子酸儿茶素二级质谱图。将对照品稀释液进行质谱测定时，碰撞能量分别为5V、10V、20V、30V、40V下所产生的表没食子酸儿茶素二级质谱图，如图2所示。[0045] (2.3)咖啡因二级质谱图。将对照品稀释液进行质谱测定时，碰撞能量分别为5V、10V、20V、30V、40V下所产生的咖啡因二级质谱图，如图3所示。[0046] (2.4)儿茶素二级质谱图。将对照品稀释液进行质谱测定时，碰撞能量分别为5V、10V、20V、30V、40V下所产生的儿茶素二级质谱图，如图4所示。[0047] (2.5)表儿茶素二级质谱图。将对照品稀释液进行质谱测定时，碰撞能量分别为5V、10V、20V、30V、40V下所产生的表儿茶素二级质谱图，如图5所示。[0048] (2.6)表没食子儿茶素没食子酸酯二级质谱图。将对照品稀释液进行质谱测定时，碰撞能量分别为5V、10V、20V、30V、40V下所产生的表没食子儿茶素没食子酸酯二级质谱图，如图6所示。[0049] (2.7)表儿茶素没食子酸酯二级质谱图。将对照品稀释液进行质谱测定时，碰撞能量分别为5V、10V、20V、30V、40V下所产生的表儿茶素没食子酸酯二级质谱图，如图7所示。[0050] (2.8)可可碱二级质谱图。将对照品稀释液进行质谱测定时，碰撞能量分别为5V、10V、20V、30V、40V下所产生的可可碱二级质谱图，如图8所示。[0051] (2.9)茶碱二级质谱图。将对照品稀释液进行质谱测定时，碰撞能量分别为5V、10V、20V、30V、40V下所产生的茶碱二级质谱图，如图9所示。[0052] (3)取待测定六堡茶样品浸泡过滤，离心后取提取液，稀释过滤得待测定样品稀释液。[0053] 其中，将所述的待测定六堡茶样品放入沸水中浸泡10min，加入待测定六堡茶样品的质量与沸水体积的比为1:10g/mL，浸泡后的液体放至室温后在4℃下离心15min，离心速度为9000r/min。[0054] (4)取步(3)所得待测定样品稀释液使用液相串联高分辨质谱测定得待测定样品图谱，将待测定样品与对比质谱图数据库中数据匹配后得到测定结果。[0055] 其中，测定结果包括是否含有儿茶素类物质和生物碱，所述的儿茶素类物质包括没食子酸、表没食子酸儿茶素、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯，所述的生物碱包括咖啡因、可可碱和茶碱。[0056] 其中，使用AgilentLC1290?6550?QTOF液相串联高分辨质谱进行测定，包括液相色谱测定和质谱测定：[0057] 所述液相色谱测定条件为：[0058] 色谱柱：C18色谱柱，3.0mm×150mm，2.7μm；进样量：3μL；柱温：30℃；流速：0.4mL/min；流动相：A:0.1％甲酸水溶液，B：乙腈；流动相梯度：0～1min：2％B；1～5min：2％B→10％B；5～15min：10％B→30％B；15～20min：30％B→40％B；20～23min：40％B→50％B；23～25min：50％B→60％B；25～27min：60％B→95％B；27～30min：95％B；30.01～35min：2％B；[0059] 所述质谱测定条件为：[0060] 干燥气温度：290℃；干燥器流速：11L/min；雾化器压力：45psi；鞘气温度：325℃；鞘气流速：8L/min；毛细管电压：3500V；喷嘴电压：250V；裂解电压380V；扫描模式为自动二级采集模式，正模式，扫描范围1级100～1000m/z，扫描范围2级50～500m/z，碰撞能量5～40V。[0061] 经过测定获取待测定样品中儿茶素类物质和生物碱的色谱图和一级质谱图，仪器工作站将测定结果与对比质谱图数据库进行匹配，当通过仪器工作站计算该物质的精确分子量匹配度达到90分以上(一级质谱匹配)，再进行二级质谱匹配。二级质谱碎片的鉴别点数根据欧盟非强制执行法案2002?657?EC中的表5进行计算达到的鉴别点数为大于等于4，即可确认待测定样品含有这个物质。鉴别点数计算方式为母离子得到鉴别点数为2，通过母离子转换得到的每个产物离子(子离子)的鉴别点数为2.5，根据定性要求在高分辨质谱至少包含一个母离子与一个由母离子转换的产物离子(子离子)。[0062] 本发明的定性方法使用高分辨质谱对六堡茶中的儿茶素类物质和生物碱进行定性，其优势在于高分辨质谱对于复杂基质中目标成分的定性具有较好的抗干扰作用。传统的液相方法对该类物质的定性是需要使用标准物质对色谱峰保留时间进行定性，在茶叶复杂基质中分离目标峰与杂质峰难度较大。如没食子酸在液相测定中保留较差，测定中容易受到与其共流出的物质干扰，在对这些共流出物与目标物分离会耗费较长的时间，由于被测样品基质有一定区别使用液相法时需先对被测样品进行一定预实验后，确定梯度方法才能正式开展检测。高分辨质谱是监测被测物质的质荷比，在不对样品中的目标物与杂质峰进行分离的情况下也能通过质荷比进行定性，本发明的定性方法中使用的测定模式为自动二级检测模式，测定仪器可对监测范围内的质荷比在达到一定响应后自动帮其进行二级质谱监测，使收集的数据能同时获得一级质谱与二级质谱结果，通过二级质谱所得数据结合所建立的数据库，根据质谱定性四分原则对被测成分进行定性，对复杂基质中的目标物定性能达到很好的准确度。使用该定性方法测定六堡茶中的儿茶素类物质和生物碱，通过数据库匹配各物质一级质谱定性均达到90分以上，二级质谱定性均满足定性的4个鉴别点数来确定是否存在该种物质，该定性方法的专属性强。[0063] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

专利地区：广西

专利申请日期：2022-01-18

专利公开日期：2024-09-17

专利公告号：2024-09-17