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专利名称：一种山药多肽及其制备方法和用途

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410946250.8

专利申请（专利权）人：吉林肽谷生物工程有限责任公司
权利人地址：吉林省白山市抚松县抚松工业集中区

专利发明（设计）人：石丰,宗树伟

专利摘要：本本发明涉及多肽技术领域，具体公开了一种山药多肽及其制备方法和用途。所述山药多肽的氨基酸序列为：ANYRTYLRRYWQKYEGK。本发明通过实验发现山药多肽可进一步改善患者的神经根型颈椎病。

主权利要求：
1.一种山药多肽，其特征在于，所述山药多肽的氨基酸序列为：ANYRTYLRRYWQKYEGK。
2.一种权利要求1所述的山药多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将新鲜山药洗净并去皮切成小块，将山药小块粉碎后搅拌均匀形成山药桨；
在30℃下使用脉冲电场处理山药浆3?5min以打断细胞壁，处理过程中电场强度设置为
25kV/cm，脉冲宽度设置为100?s，脉冲数设置为80?100次，电极间距设置为2?5cm；
用柠檬酸将山药桨的pH值调节至6.0，加入山药桨质量1.5%的转谷氨酰胺酶，在30℃下酶解1.5h；加入山药桨质量1.5%的复合酶，在25℃且pH6.0条件下酶解2小时，然后在30℃且pH7.0条件下酶解2小时，在30℃且pH8.0条件下酶解2小时后得到山药酶解液，所述复合酶为中性蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶，复合酶中的中性蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶的质量比为：2:1:1；将酶解山药酶解液置于高压灭酶装置中，将压力设置为100MPa下处理5min后，以6500rpm离心12分钟，收集山药上清液；
将山药上清液使用超临界CO2提取3小时，提取过程中提取压力设置为350bar，提取温度设置为45℃，流速控制在2kg/h，获得纯化的山药多肽；
将纯化的山药多肽溶解成100mg/Ml；使用色谱柱进行HPLC分离，色谱柱的第一柱为亲水交互色谱柱，第二柱为反相色谱柱，第三柱为强阳离子交换色谱柱；
第一柱中洗脱剂为体积比为95:5的0.1%三氟乙酸溶液和乙腈，洗脱条件：20min，流速为0.5mL/min；
第二柱中洗脱剂A为0.1%三氟乙酸水溶液，洗脱剂B为0.1%三氟乙酸乙腈溶液，梯度洗脱条件：95%洗脱剂A，5%洗脱剂B，5min，1mL/min；梯度上升至50%洗脱剂B，30min，1mL/min；
快速上升至100%洗脱剂B，5min，1mL/min；
第三柱中，洗脱剂A为pH3.0的20mM磷酸盐缓冲液；洗脱剂B为pH3.0的20mM磷酸盐缓冲液，洗脱剂B中还含有浓度为1M的NaCl；梯度洗脱条件：100%洗脱剂A，10min，1mL/min；逐渐增加洗脱剂B至100%，20min，1mL/min；保持100%洗脱剂A，5min，1mL/min；
三个色谱柱的柱温设置为35℃，长度为190mm，内径为4.8mm，粒径5μm，监测波长的主波长为280nm，次波长为214nm；根据高效液相色的色谱峰进行分数采集，收集目标波谱峰对应的部分；
对分离出的样品进行质谱分析，使用液相色谱?串联质谱技术进行处理，识别多肽质量峰和可能的碎片离子，匹配碎片离子并推断氨基酸序列，使用数据库匹配或蛋白质信息资源来识别和验证多肽，确认收集到的样品的氨基酸序列符合目标序列ANYRTYLRRYWQKYEGK，对通过质谱鉴定的目标肽段进行核磁共振分析，验证其分子结构的准确性。
3.一种如权利要求1所述的山药多肽在制备改善神经根型颈椎病药物的应用。 说明书 : 一种山药多肽及其制备方法和用途技术领域[0001] 本发明涉及多肽技术领域，具体是涉及一种山药多肽及其制备方法和用途。背景技术[0002] 颈椎病是现代社会中普遍存在的一种退行性疾。孀湃丝诶狭浠腿粘９ぷ髯耸撇坏钡脑龆，其发病率不断上升。特别是神经根型颈椎。溆捎谧导渑掏嘶，骨质增生或软组织压迫而导致邻近神经根受到刺激或压迫，从而产生一系列症状，包括颈部和肩部的疼痛、手臂麻木、力量减弱等，严重影响患者的生活质量与工作效率。[0003] 山药药食同源，在日常食用和传统药用中被广泛使用。近年来，科学研究发现，山药中的山药多肽，具有多种功效，并对应产生多种应用，但目前尚未见报道山药多肽在改善神经根型颈椎病的用途。发明内容[0004] 本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种山药多肽及其制备方法和用途。为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：[0005] 第一方面，本发明提供了一种山药多肽，该山药多肽的氨基酸序列为：ANYRTYLRRYWQKYEGK。[0006] 第二方面，本发明提供了上述山药多肽的制备方法，包括以下步骤：[0007] 将新鲜山药洗净并去皮切成小块，将山药小块粉碎后搅拌均匀形成山药桨；[0008] 在30℃下使用脉冲电场处理山药浆3?5min以打断细胞壁，处理过程中电场强度设置为25kV/cm，脉冲宽度设置为100?s，脉冲数设置为80?100次，电极间距设置为2?5cm；[0009] 用柠檬酸将山药桨的pH值调节至6.0，加入山药桨质量1.5%的转谷氨酰胺酶，在30℃下酶解1.5h；加入山药桨质量1.5%的复合酶，在25℃且pH6.0条件下酶解2小时，然后在30℃且pH7.0条件下酶解2小时，在30℃且pH8.0条件下酶解2小时后得到山药酶解液，所述复合酶为中性蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶，复合酶中的中性蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶的质量比为：2:1:1；将酶解山药酶解液置于高压灭酶装置中，将压力设置为100MPa下处理5min后，以6500rpm离心12分钟，收集山药上清液；[0010] 将山药上清液使用超临界CO2提取3小时，提取过程中提取压力设置为350bar，提取温度设置为45℃，流速控制在2kg/h，获得纯化的山药多肽；[0011] 将纯化的山药多肽溶解成100mg/Ml；使用色谱柱进行HPLC分离，色谱柱的第一柱为亲水交互色谱柱，第二柱为反相色谱柱，第三柱为强阳离子交换色谱柱；[0012] 第一柱中洗脱剂为体积比为95:5的0.1%三氟乙酸溶液和乙腈，洗脱条件：20min，流速为0.5mL/min；[0013] 第二柱中洗脱剂A为0.1%三氟乙酸水溶液，洗脱剂B为0.1%三氟乙酸乙腈溶液，梯度洗脱条件：95%洗脱剂A，5%洗脱剂B，5min，1mL/min；梯度上升至50%洗脱剂B，30min，1mL/min；快速上升至100%洗脱剂B，5min，1mL/min；[0014] 第三柱中，洗脱剂A为pH3.0的20mM磷酸盐缓冲液；洗脱剂B为pH3.0的20mM磷酸盐缓冲液，洗脱剂B中还含有浓度为1M的NaCl；梯度洗脱条件：100%洗脱剂A，10min，1mL/min；逐渐增加洗脱剂B至100%，20min，1mL/min；保持100%洗脱剂A，5min，1mL/min；[0015] 三个色谱柱的柱温设置为35℃，监测波长为280nm；根据高效液相色的色谱峰进行分数采集，收集目标波谱峰对应的部分；[0016] 对分离出的样品进行质谱分析，使用液相色谱?串联质谱技术进行处理，识别多肽质量峰和可能的碎片离子，匹配碎片离子并推断氨基酸序列，使用数据库匹配或蛋白质信息资源来识别和验证多肽，确认收集到的样品的氨基酸序列符合目标序列ANYRTYLRRYWQKYEGK，对通过质谱鉴定的目标肽段进行核磁共振分析，验证其分子结构的准确性。[0017] 第三方面，本发明还提供了上述山药多肽在制备改善非酒精性脂肪肝药物的应用。[0018] 第四方面，本发明提供了人工合成的山药多肽，所述山药多肽的氨基酸序列为：ANYRTYLRRYWQKYEGK。[0019] 本发明与现有技术不同之处在于本发明取得了如下技术效果：[0020] 本发明通过实验发现实验结果表明，氨基酸序列为：ANYRTYLRRYWQKYEGK的山药多肽可进一步改善患者的肝功能，改善神经根型颈椎。，山药多肽的使用不会增加患者相关不良反应情况的发生风险，安全性理想。附图说明[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。[0022] 图1为本发明实施例提供的对照组和实验组的中医症状积分变化对比；[0023] 图2为本发明实施例提供的对照组和实验组的颈椎日本骨科协会评分对比；[0024] 图3为本发明实施例提供的对照组和实验组的简化McGill疼痛问卷表（SF?MPQ）结果对比；[0025] 图4为本发明实施例提供的对照组和实验组的血清中炎症因子TNF?α和IL?1β水平结果对比；[0026] 图5为发明实施例提供的山药多肽的核磁共振氢谱图。具体实施方式[0027] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径获得。[0028] 实施例1[0029] 本发明实施例1公开了一种山药多肽，该山药多肽的氨基酸序列为：ANYRTYLRRYWQKYEGK。[0030] 实施例2[0031] 本发明实施例2公开了一种山药多肽的制备方法，包括以下步骤：[0032] 将新鲜山药洗净并去皮切成小块，将山药小块粉碎后搅拌均匀形成山药桨；[0033] 在30℃下使用脉冲电场处理山药浆3?5min以打断细胞壁，处理过程中电场强度设置为25kV/cm，脉冲宽度设置为100?s，脉冲数设置为80?100次，电极间距设置为2?5cm；[0034] 用柠檬酸将山药桨的pH值调节至6.0，加入山药桨质量1.5%的转谷氨酰胺酶，在30℃下酶解1.5h；加入山药桨质量1.5%的复合酶，在25℃且pH6.0条件下酶解2小时，然后在30℃且pH7.0条件下酶解2小时，在30℃且pH8.0条件下酶解2小时后得到山药酶解液，所述复合酶为中性蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶，复合酶中的中性蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶的质量比为：2:1:1；将酶解山药酶解液置于高压灭酶装置中，将压力设置为100MPa下处理5min后，以6500rpm离心12分钟，收集山药上清液；[0035] 将山药上清液使用超临界CO2提取3小时，提取过程中提取压力设置为350bar，提取温度设置为45℃，流速控制在2kg/h，获得纯化的山药多肽；[0036] 将纯化的山药多肽溶解成100mg/Ml；使用色谱柱进行HPLC分离，色谱柱的第一柱为亲水交互色谱柱，第二柱为反相色谱柱，第三柱为强阳离子交换色谱柱；[0037] 第一柱中洗脱剂为体积比为95:5的0.1%三氟乙酸溶液和乙腈，洗脱条件：20min，流速为0.5mL/min；[0038] 第二柱中洗脱剂A为0.1%三氟乙酸水溶液，洗脱剂B为0.1%三氟乙酸乙腈溶液，梯度洗脱条件：95%洗脱剂A，5%洗脱剂B，5min，1mL/min；梯度上升至50%洗脱剂B，30min，1mL/min；快速上升至100%洗脱剂B，5min，1mL/min；[0039] 第三柱中，洗脱剂A为pH3.0的20mM磷酸盐缓冲液；洗脱剂B为pH3.0的20mM磷酸盐缓冲液，洗脱剂B中还含有浓度为1M的NaCl；梯度洗脱条件：100%洗脱剂A，10min，1mL/min；逐渐增加洗脱剂B至100%，20min，1mL/min；保持100%洗脱剂A，5min，1mL/min；[0040] 三个色谱柱的柱温设置为35℃，监测波长为280nm；根据高效液相色的色谱峰进行分数采集，收集目标波谱峰对应的部分；[0041] 对分离出的样品进行质谱分析，使用液相色谱?串联质谱技术进行处理，识别多肽质量峰和可能的碎片离子，匹配碎片离子并推断氨基酸序列，使用数据库匹配或蛋白质信息资源来识别和验证多肽，确认收集到的样品的氨基酸序列符合目标序列ANYRTYLRRYWQKYEGK，对通过质谱鉴定的目标肽段进行核磁共振分析，验证其分子结构的准确性，具体请参见图5，其为发明实施例提供的山药多肽的核磁共振氢谱图，化学位移和峰验证了目标序列分子结构的准确性。[0042] 实施例3[0043] 1、研究对象[0044] 选择110例神经根型颈椎病患者作为研究对象，收集患者性别、年龄、病程、疾病类型等基础资料信息。根据患者所接受治疗干预的不同将其均分为对照组与实验组，每组各55例。对照组患者接受纯电针疗法进行治疗，实验组患者在对照组患者的治疗基础上加用氨基酸序列为：ANYRTYLRRYWQKYEGK的山药多肽。[0045] 2、纳入及排除标准[0046] 纳入标准：1、根据《神经根型颈椎病诊疗规范化的专家共识》确诊为神经根型颈椎。〕讨辽6个月，且症状无自然缓解趋势或经常规非手术治疗无显著改善；2、患者的病例资料完整；3、患者的生命体征平稳，清醒合作，无沟通障碍，能配合基础治疗；4、患者年龄范围为18?65岁。[0047] 排除标准：1、合并有急性颈椎间盘突出、颈椎骨折、肿瘤等病史；2、对电针治疗有明显过敏反应史；3、合并重要脏器功能衰竭或严重心脑血管疾。4、孕妇或哺乳期妇女；5、精神病患者或认知功能障碍无法配合完成本研究。[0048] 3、方法[0049] 所有患者入院时均给予常规治疗干预，常规治疗干预包括完善相关检查，予以控制血糖、保护脑细胞、抗血小板聚集等治疗并辅以合理饮食、适当运动。[0050] 3.1、对照组[0051] 对照组的治疗方案采用纯电针疗法。具体做法如下：患者取俯卧位，对目标穴位进行标准消毒操作。使用规格为0.25mm×40mm的一次性针灸针针刺颈部的特定穴位，包括风池穴（双侧）、每个颈椎间的夹脊穴（C3至C7区间）、大椎穴以及肩井穴（双侧）。针灸操作时针刺至患者感受到酸胀感为宜，并采用平补平泻的手法。随后，在夹脊穴C3至C7区间的两侧接入型号为BT701?1B的电针仪，设定为疏波形态，频率为2Hz，并根据患者舒适度调整电流强度，持续治疗20分钟。疗程设置为每日一次，每周三次，共计10次完成一个疗程。[0052] 3.2、实验组[0053] 实验组患者电针疗法的治疗方式方法与对照组保持一致，实验组患者在对照组患者的治疗基础上加用实施例1的山药多肽治疗，口服剂量150mg/次，3次/d，持续服用12周。[0054] 4、观察指标[0055] 观察所有患者治疗前后中医症状积分，其通过评估患者症状的严重程度进行量化。各症状（如疼痛、麻木、僵硬）根据其出现频率和强度进行分级，并赋予相应的分值。症状按严重程度和频率进行评分，总分范围为0?150分。分值越高，表明症状越严重，用于量化中医症状的客观化评估。JOA评分系统用于评估颈椎疾病对日常生活的影响，涉及手臂功能、手指灵活度、上肢疼痛强度、下肢功能、膀胱功能等多个方面。根据患者症状和功能损失程度进行评分，评分后加总得到总分。总分从0分（功能丧失）至满分（无功能损害），总分范围为0?17分。SF?MPQ提供15个描述性词语，分为感觉和情感两部分，及视觉模拟量表（VAS）评估痛苦的主观经历。患者选择符合自身疼痛感觉的词语，并在VAS上标注疼痛强度。词语选中与否及VAS标注位置共同决定分值。总分为0?45分。抽取患者清晨空腹肘静脉血5ml,3500rpm离心5min，取上清,ELISA检测炎症因子TNF?α和IL?1β水平。[0056] 5、统计分析[0057] 使用描述性统计来概述数据的基本特征。运用配对t检验分析治疗前后数据的变化情况。独立样本t检验或Mann?WhitneyU检验用于比较两组间的差异。对于分类变量，使用卡方检验作为比较的工具。对于所有的统计测试，设定显著性水平为P<0.05。[0058] 6、结果[0059] 6.1、基线特征[0060] 在治疗前两组患者的年龄、性别分布以及体质量指数（BMI）之间无显著性差异（P>0.05），见表1，表示两组患者数据具有可比性。[0061] 表1基线特征和临床资料[0062][0063] 6.2中医症状积分[0064] 如图1和表2所示，与对照组相比，实验组在治疗后肝功能指标均显著降低（P<0.05），包括碱性磷酸酶（ALP）、丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）。实验组ALP水平从治疗前的165.24±28.45U/L下降到治疗后的118.67±22.13U/L，而对照组从163.55±27.99U/L减少到146.88±25.62U/L；差异具有显著性（P<0.001）。并且两组间差异在ALT水平上表现的更为明显，实验组ALT水平从52.84±14.76U/L降到33.25±10.58U/L，而对照组由53.17±15.03U/L降至46.58±13.47U/L（P<0.001）。两组间AST水平的对比也反映了类似情况，实验组从48.92±12.37U/L减少到30.63±9.84U/L，对照组则从49.28±12.58U/L降至42.51±11.69U/L（P<0.001），具体参见图1。[0065] 表2中医症状积分变化比较[0066][0067] 6.3、颈椎日本骨科协会（JOA）评分[0068] 如图2和表3所示，与对照组相比，观察组患者治疗后JOA评分明显升高（P<0.001），说明观察组患者颈椎功能恢复得到了明显改善。[0069] 表3颈椎日本骨科协会（JOA）评分变化比较[0070][0071] 6.4、简化McGill疼痛问卷表（SF?MPQ）结果[0072] 如图3和表4所示，治疗前2组患者SF?MPQ评分无明显差异（P>0.05），治疗后，观察组患者SF?MPQ评分较对照组明显下降（P<0.001）。[0073] 表4简化McGill疼痛问卷表（SF?MPQ）结果[0074][0075] 6.5、血清中炎症因子TNF?α和IL?1β水平[0076] 如图4和表5所示，治疗前，两组患者TNF?α和IL?1β水平均无明显差异（P>0.05），治疗后，观察组患者TNF?α和IL?1β水平较对照组明显下降（P<0.001）。[0077] 表5血清中炎症因子TNF?α和IL?1β水平变化[0078][0079] 7、结论[0080] 在上述实施例中，治疗前两组患者在基线特征上没有显著差异，为后续效果的客观评价提供了良好的前提。治疗后实验组在改善中医症状积分、JOA评分、SF?MPQ评分以及降低血清中炎症因子TNF?α和IL?1β水平方面均优于对照组。山药多肽与纯电针疗法的联合使用可产生协同效应，从多个方面改善患者的神经根型颈椎病的症状。这些数据为山药多肽联合纯电针疗法在神经根型颈椎病治疗中提供了临床佐证。[0081] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

专利地区：吉林

专利申请日期：2024-07-16

专利公开日期：2024-09-10

专利公告号：CN118480091B