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专利名称：废次烟草中高值成分茄尼醇的制备方法及应用

专利类型：实用新型专利

专利申请号：CN202211320661.3

专利申请（专利权）人：贵州汇腾开云优惠体育网页版入口有限公司
权利人地址：贵州省遵义市汇川区汇川大道遵义国家经济技术开发区V谷食品工业园

专利发明（设计）人：杨再文,聂绪强,冉义斌,刘逸秋,罗晓琴,刘杰,赵娅,周孝红

专利摘要：本申请公开了药物开发技术领域中废次烟草中高值成分茄尼醇的制备方法，以废次烟草作为原料，通过皂化和超临界二氧化碳流体萃取技术提取茄尼醇，采用HPLC法对茄尼醇含量进行检测，茄尼醇的纯度为71.13％。通过抗人肺腺癌细胞系A549、胰腺癌细胞系AsPC?1、结肠癌细胞系HT29细胞增殖活性实验得出茄尼醇具有抗肿瘤活性，其有望作为潜在的抗肿瘤剂，用于功能性食品、药物的开发。

主权利要求：
1.废次烟草中高值成分茄尼醇在制备抗胰腺癌药物或胰腺癌细胞增殖抑制剂中的应用。 说明书 : 废次烟草中高值成分茄尼醇的制备方法及应用技术领域[0001] 本发明涉及药物开发技术领域，具体涉及废次烟草中高值成分茄尼醇的制备方法及应用。背景技术[0002] 茄尼醇是一种不饱和的聚异戊二烯醇，属三倍半萜醇，分子式为C45H74O，分子量631.07，为蜡状类淡黄色固体，熔点42℃，易溶于有机溶剂，不溶于水，无旋光活性，通常茄尼醇占烟草总重的0.3％一3％。茄尼醇在生物化学和药物化学中有着非常重要的作用，是药物合成的重要原料。由于茄尼醇本身含有多个非共轭双键，具有非常强烈的吸收自由基的性能。大量的研究结果表明，茄尼醇具有较强的抗癌生物活性，是合成心血管疾病、抗癌、抗溃疡等新型药物的中间体，如作为合成辅酶Q10、维生素K2的侧链以及合成抗溃疡药物、抗癌药物原料，在医学上用途广泛。茄尼醇主要存在于茄科植物中的叶绿体和纤维组织中，以烟叶、马铃薯叶和桑叶中含量突出，其在烟叶中的含量高达叶片干重的3％。[0003] 我国烟草植物的种植面积和产量均居世界首位，烟草种植与产品加工在国民经济发展中发挥着重要的作用，烟草在我国农产品收入中，仅次于稻、麦、棉、大豆、玉米，居第六位。目前国内外种植的烟草主要用作卷烟。作为烟草生产大国，我国每年烟叶产量500万吨，其中约有近25％的烟叶、烟未等下脚料被废弃，不能用于卷烟生产。若对这些烟草进行资源化利用，不仅可以获得符合绿色卫生标准的天然化工原料，为企业挖潜改造提供可持续发展的契机，也可以减轻废弃烟草对土质和土壤结构改变的可能：π，避免其中有害成分对地下水的污染。因此，加强废弃烟草的综合利用不但可以使这部分废物变为宝贵的资源，也能提高烟农的经济收入，更符合国家固体废弃物“资源化”的方针。[0004] 公开号CN107698426A的中国专利介绍了本发明经过整体皂化、分离、重结晶等工艺步骤提取茄尼醇，所述整体皂化的具体步骤为：取废次烟叶浸膏溶于苯中，搅拌均匀，另将2倍量的质量体积比为1∶1的氢氧化钾的甲醇溶液在剧烈搅拌下慢慢加入上述浸膏的苯溶液中，控制温度不超过60℃，搅拌10?30min，静置过夜；倾出上清液，沉淀用乙醚提。喜⒁颐岩河肷锨逡海患尤4?5倍量乙醚和2?3倍量水，剧烈搅拌后静置分层，有机相用水洗3?5次后，蒸除溶剂，得到粗品收率可达50％以上。但是上述工艺生产的茄尼醇粗品纯度较低，且生产效率较低。超临界二氧化碳萃取技术是利用超临界二氧化碳具有良好的溶解特性和传质特性，从液体或固体中萃取有效成分并进行分离的一种新型精制技术。可通过控制压力和温度调节超临界二氧化碳的溶剂化能力，有针对性地萃取所需成份。在超临界状态下，超临界二氧化碳与待分离的物质接触，萃取物质则基本或完全析出，从萃取到分离一步完成，萃取速度快，对脂溶性物质溶解度大。[0005] 因此，将超临界二氧化碳萃取与上述皂化工艺结合在一起，使得从废次烟草中分离出的茄尼醇纯度更高是现有技术亟需解决的。发明内容[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供一种利用皂化和超临界二氧化碳流体萃取技术结合的废次烟草中茄尼醇的制备方法。[0007] 本申请的目的之一是提供废次烟草中高值成分茄尼醇的制备方法，将废次烟草干燥打粉，然后与蒸馏水混合搅拌，离心去除浸取液，取固体干燥；将干燥后的固体加入NaOH的乙醇溶液，皂化，冷却后调节pH接近7，离心，弃去上清液，将处理过的烟叶干燥；干燥后的烟叶与夹带剂混合放入萃取釜，用超临界二氧化碳萃。占腿∥铮唤腿∥镉眯舴⒁墙屑跹古ㄋ，同时回收夹带剂，得到浓缩浸膏，将浓缩浸膏置于冷冻干燥机内冷冻,干燥至样品恒重后收集样品，得到茄尼醇。[0008] 具体的，超临界二氧化碳萃取条件：萃取压力35MPa，萃取温度50℃，夹带剂为90％乙醇，碎烟叶和夹带剂按质量体积比1:1(W/V)，分离釜Ⅰ压力为7MPa，温度40℃，分离釜Ⅱ压力为6MPa，温度35℃，萃取时间共3h；按程序升温加压，达到设定条件后，维持静态萃取1h；然后进行动态萃取2h，二氧化碳流量4.5L/h。[0009] 进一步的，具体包括以下步骤：1)将干燥废次烟草粉碎后，过20?40目筛得粉末状烟末，然后将碎烟叶和蒸馏水按质量体积比10g：100mL，在室温下采用机械搅拌lh，采用离心机除去浸取液，处理过的烟叶放置于60℃下干燥；[0010] 2)称取经过步骤1)处理的烟叶，加入NaOH的乙醇溶液，其中NaOH的摩尔浓度为0.16?0.17mol/L，碎烟叶和NaOH的乙醇溶液的比例为重量：体积＝10g：30ml，在60℃下机械搅拌2h进行皂化，冷却后用lmol/L盐酸调节混合物的pH接近7；离心，弃去上清液，将处理过的烟叶晾干或于50℃烘干；[0011] 3)将经过步骤2)处理后的烟叶与夹带剂混合放入萃取釜，或者将经过步骤1)处理的烟叶直接放入萃取釜，通过泵输入夹带剂；超临界二氧化碳萃取条件：萃取压力35MPa，萃取温度50℃，夹带剂为90％乙醇，碎烟叶和夹带剂按质量体积比1:1(W/V)，分离釜Ⅰ压力为7MPa，温度40℃，分离釜Ⅱ压力为6MPa，温度35℃，萃取时间共3h；按程序升温加压，达到设定条件后，维持静态萃取1h；然后进行动态萃取2h，二氧化碳流量4.5L/h；分别收集分离釜I和分离釜II的萃取物；[0012] 4)将经过步骤3)处理得到的超临界萃取产物采用旋转蒸发仪进行减压浓缩，同时回收夹带剂，减压浓缩时温度为40℃，真空度为0.07～0.09MPa；[0013] 5)将经过步骤4)处理的浓缩浸膏于?20℃冰箱中预冷冻24h,待冷阱温度保持在?60℃时,将其置于冷冻干燥机内冷冻,干燥至样品恒重后收集样品。[0014] 本发明还提供上述方法提取的茄尼醇在制备肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用。[0015] 其中肿瘤细胞为人肺腺癌细胞系A549、胰腺癌细胞系AsPC?1、结肠癌细胞系HT29细胞。[0016] 将茄尼醇与人肺腺癌细胞系(A549)、胰腺癌细胞系(AsPC?1)、结肠癌细胞系(HT29)共培养，通过MTT比色法检测细胞增殖活性，茄尼醇在80～320μmol/L范围内对胰腺癌细胞系AsPC?1和结肠癌细胞系HT29活性有明显抑制作用，且呈浓度依赖性，IC50值分别为597.4μmol和514.1μmol。茄尼醇在160～320μmol/L范围内对抗人肺腺癌细胞系A549活性有明显抑制作用，且呈浓度依赖性，IC50值为426.9μmol。[0017] 本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：[0018] (1)本发明进行了茄尼醇的制备，以废次烟草为原料，变废为宝，可促进经济发展，经济效益高。[0019] (2)采用皂化加超临界二氧化碳萃取的方式，通过优化反应条件，获得纯度更高活性更好的茄尼醇，尤其是对人肺腺癌细胞系A549的抑制活性，多个浓度均高达90％以上。且生产效率高，减少了“三废”的排放，减轻了环境污染。[0020] (3)本发明将茄尼醇应用于抗肿瘤药物的开发研究，开拓了茄尼醇在食品级保健品、抗肿瘤的新药研发方面的新思路。附图说明[0021] 图1为超临界二氧化碳萃取产物采用高效液相色谱仪进行测试的色谱图；[0022] 图2为不同浓度茄尼醇对人肺腺癌细胞系A549细胞活力的影响；[0023] 图3为不同浓度茄尼醇对胰腺癌细胞系AsPC?1细胞活力的影响；[0024] 图4为不同浓度茄尼醇对结肠癌细胞系HT29细胞活力的影响。具体实施方式[0025] 下面通过具体实施方式进一步详细说明：[0026] 废次烟草中茄尼醇的提取[0027] 将干燥废次烟草粉碎后，过20?40目筛得粉末状烟叶。称取1000g烟草粉末，将碎烟叶和蒸馏水按质量体积比10g：100mL，在室温下采用机械搅拌lh。采用离心机除去浸取液，处理过的烟叶放置于60℃下干燥。取处理后的干燥烟叶，加入NaOH的乙醇溶液，其中NaOH的摩尔浓度为0.16?0.17mol/L，碎烟叶和NaOH的乙醇溶液的比例为重量：体积＝10g：30ml。在60℃下机械搅拌2h进行皂化。冷却后用lmol/L盐酸调节混合物的pH接近7；离心，弃去上清液，将处理过的烟叶晾干或于50℃烘干。将预处理后的烟草放入超临界萃取釜(5L)中，密封超临界二氧化碳萃取装置，按程序升温加压，达到设定条件后，维持静态萃取1h。然后进行动态萃取2h。萃取条件为：二氧化碳流量4.5L/h，萃取压力35MPa，萃取温度50℃，夹带剂为90％乙醇，碎烟叶和夹带剂按质量体积比1:1(W/V)，通过夹带剂泵定量打入夹带剂；分离釜Ⅰ压力为7MPa，温度40℃，分离釜Ⅱ压力为6MPa，温度35℃。动态萃取结束后，收集分离釜I和分离釜II的萃取物。超临界萃取产物采用旋转蒸发仪进行减压浓缩，同时回收夹带剂，减压浓缩时温度为40℃，真空度为0.07～0.09MPa；将浓缩浸膏于?20℃冰箱中预冷冻24h,待冷阱温度保持在?60℃时,将其置于冷冻干燥机内冷冻,干燥至样品恒重后收集样品。[0028] 见图1，经HPLC检测分析，提取茄尼醇的纯度为71.13％。[0029] 茄尼醇对肿瘤细胞增殖的抑制活性测定[0030] (1)细胞株，试剂与仪器[0031] 人肺腺癌细胞系A549、胰腺癌细胞系AsPC?1、结肠癌细胞系HT29。DMEM培养基(GIBCO)，胎牛血清(BI)，胰蛋白酶(索莱宝)，DMSO(索莱宝)，青链霉素双抗溶液(HyClone)，96孔板，细胞培养箱(Thermo)，酶标仪(Thermo)，超净工作台。[0032] (2)细胞培养方法[0033] 基础培养基DMEM+10％FBS(胎牛血清)，培养条件为培养条件为37℃，5％二氧化碳浓度及饱和湿度；当细胞生长至对数期时，用胰蛋白酶消化细胞，冼涤吹散细胞，以每孔5000个细胞接种于96孔板，每孔体积100μl。细胞提前24小时接种培养，以备MTT实验。[0034] (3)细胞增殖实验(MTT法)[0035] 将茄尼醇溶于DMSO溶液，配制浓度为800μmol/L的母液。待细胞贴壁后，随机分为对照组和茄尼醇不同浓度组(终浓度为80、160、240、320μmol/L)，另设不含细胞只含完全培养基的空白组，每组设置3个复孔。对照组加入含0.4％DMSO的完全培养基100μL，茄尼醇各浓度组分别加入含相应药物的完全培养基100μL，培养24h时，向各组细胞加入MTT溶液20μL，于37℃条件下孵育4h后，以2500r/min离心15min，弃上清；沉淀中加入DMSO150μL，在摇床上避光振荡30min，采用酶标仪于490nm波长处测定各孔吸光度(OD)，计算细胞存活率。[0036] (4)实验结果[0037][0038] 表1茄尼醇对三种细胞株的抗增殖活性数据[0039][0040] 从表1中可以看出：茄尼醇对人肺腺癌细胞系A549、胰腺癌细胞系AsPC?1、结肠癌细胞系HT29均显示出显著的细胞增殖抑制活性。茄尼醇对人肺腺癌细胞系A549、胰腺癌细胞系AsPC?1、结肠癌细胞系HT29细胞抑制率影响图，分别见图2、图3、图4。茄尼醇在80～320μmol/L范围内对胰腺癌细胞系AsPC?1和结肠癌细胞系HT29活性有明显抑制作用，且呈浓度依赖性，IC50值分别为597.4μmol/L和514.1μmol/L。茄尼醇在160～320μmol/L范围内对抗人肺腺癌细胞系A549活性有明显抑制作用，且呈浓度依赖性，IC50值为426.9μmol/L。本发明为茄尼醇的抗癌或辅助治疗作用研究奠定了一定的基础。[0041] 以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

专利地区：贵州

专利申请日期：2022-10-26

专利公开日期：2024-09-03

专利公告号：CN115784842B