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专利名称：OBSCN新抗原表位肽及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410225091.2

专利申请（专利权）人：漯河医学高等专科学校
权利人地址：河南省漯河市源汇区大学路148号

专利发明（设计）人：时冉冉,郭伟,冉令,田园,陈娇,宋田田

专利摘要：本发明属于生物医药技术领域，具体公开了OBSCN新抗原表位肽及其在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。本发明提供的OBSCN新抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1?4所示，该表位肽能够有效刺激并诱导产生具有肿瘤杀伤功能的突变表位肽特异性的CD8+T淋巴细胞，特异性杀伤新抗原阳性表达的肿瘤细胞。并且，表位肽所含抗原表位的患者覆盖率高，将其制成预防和/或治疗肿瘤的药物(如疫苗、细胞制剂等)具有良好的治疗潜力和应用前景。本发明提供的药物包含OBSCN新抗原表位肽或其编码核酸、或者特异性识别OBSCN新抗原表位的T细胞抗原受体或嵌合抗原受体或其编码核酸，具有较高的临床应用价值。

主权利要求：
1.OBSCN新抗原表位肽，其特征在于：所述新抗原表位肽的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。
2.编码如权利要求1所述的OBSCN新抗原表位肽的核酸。
3.如权利要求1所述的OBSCN新抗原表位肽、或者如权利要求2所述的编码OBSCN新抗原表位肽的核酸在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；
所述肿瘤为乳腺癌。
4.一种预防和/或治疗肿瘤的药物，其特征在于：所述药物包含如权利要求1所述的OBSCN新抗原表位肽。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于：所述药物为可诱导机体产生特异性的针对具有OBSCNV327L突变的肿瘤的细胞毒性T细胞克隆的疫苗。
6.根据权利要求4或5所述的药物，其特征在于：所述药物的剂型为粉针剂或注射液。 说明书 : OBSCN新抗原表位肽及其应用技术领域[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及OBSCN新抗原表位肽及其在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。背景技术[0002] 肿瘤免疫治疗是继手术、化疗、放疗等传统治疗方法后快速发展的新一代肿瘤治疗方法，具有巨大的临床应用前景。肿瘤免疫治疗主要通过调控机体免疫系统启动或重启机体的抗肿瘤功能，从而实现杀灭肿瘤的目的。[0003] 研究表明，肿瘤免疫治疗的临床疗效很大程度上取决于肿瘤患者中存在的肿瘤抗+原特异性的CD8T淋巴细胞，而肿瘤抗原在其中扮演着重要的角色。理想的肿瘤抗原是仅在肿瘤细胞中表达而在正常细胞中不表达的肿瘤特异性抗原。而新抗原是肿瘤特异性突变产生的一类肿瘤特异性抗原，因其在正常细胞中不表达而具有较高的免疫原性，可通过激活+ +CD4T淋巴细胞和CD8T淋巴细胞产生强烈的免疫反应，被认为是最理想的肿瘤免疫治疗靶点之一。新抗原中能够特异性激活T淋巴细胞的表位又称新表位，已在肿瘤免疫治疗中显现出独特的优势。[0004] 研究发现，OBSCN基因突变常发生于各种癌症中，尤其是乳腺癌。OBSCN在癌症易感性和肿瘤进展中起着重要作用，其功能突变可能通过β?连环蛋白影响Wnt信号通路。值得注意的是，在超过13000个候选基因中，OBSCN和TP53共同突变于乳腺癌和结直肠癌中。TP53已经有很多研究报道，但OBSCN在肿瘤发生中的机制还不清楚，在正常乳腺上皮细胞中，OBSCN可能具有抑制肿瘤形成和转移的作用。[0005] 中国专利CN116970058B公开了一种基于MHC?II类分子的针对肿瘤驱动基因TP53上R249S突变的新抗原多肽，其氨基酸序列为MGGMNRSPILTIITL或SSCMGGMNRSPILTI，前者能激活HLA分型为HLA?DRB1*07:01的T细胞，后者能激活HLA分型为HLA?DQA1*02:01/DQB1*03:01的T细胞，并增强T细胞对具有TP53R249S突变的肿瘤细胞的杀伤能力，可用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物。此外，中国专利CN116948004B公开了一种针对肿瘤驱动基因CTNNB1上H36P突变的新抗原多肽，其氨基酸序列为QSYLDSGIPSGATTT或PSGATTTAPSLSGKG，二者能激活HLA分型为HLA?DQA1*02:01/DQB1*03:01的T细胞，增强T细胞对CTNNB1H36P突变的肿瘤细胞的杀伤能力，弥补了个体化抗原肽在同时具有HLA?DQA1*02:01/DQB1*03:01基因型和CTNNB1?H36P体细胞突变的肿瘤病人治疗中的空白。[0006] 然而，目前鉴定的绝大多数新抗原为肿瘤患者所特有，人群覆盖率低，严重制约了基于新表位的肿瘤免疫疗法的临床应用。HLA?A2亚型在中国人群中占比为50％左右，因此鉴定HLA?A2限制性新抗原表位具有广泛的人群覆盖率，可为基于新抗原的肿瘤免疫治疗提供新的候选和策略。发明内容[0007] 本发明主要解决的技术问题是提供一种OBSCN新抗原表位，以及包含该新抗原表位的多肽或其编码核酸在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。[0008] 同时，本发明还提供一种预防和/或治疗肿瘤的药物。[0009] 为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：[0010] OBSCN新抗原表位肽，所述新抗原表位肽包含OBSCNV327L突变或A1348V突变。[0011] 作为本发明一种优选的实施方案，所述新抗原表位肽包含如SEQIDNO：1或2所示的氨基酸序列。[0012] OBSCNV327L(5aa)：LV[L]VR(SEQIDNO：1)；[0013] OBSCNA1348V(5aa)：SEPK[V](SEQIDNO：2)。[0014] 作为本发明一种优选的实施方案，所述新抗原表位肽的氨基酸序列如SEQIDNO：3或4所示：[0015] OBSCNV327L(10aa)：VLV[L]VREPAV(SEQIDNO：3)；[0016] OBSCNA1348V(10aa)：FHLDVSEPK[V](SEQIDNO：4)。[0017] 编码OBSCN新抗原表位肽的核酸，所述核酸为DNA或RNA。[0018] 作为本发明一种优选的实施方案，在不改变编码的氨基酸序列的前提下，可以根据密码子的偏好性对核酸序列进行修饰改造。[0019] OBSCN新抗原表位肽或其编码核酸的应用，所述应用具体为：在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。[0020] 作为本发明一种优选的实施方案，所述药物包括但不限于疫苗、细胞制剂。[0021] 具体的，所述药物为可以诱导机体产生特异性的针对具有OBSCNV327L突变或A1348V突变的肿瘤的细胞毒性T细胞克隆的疫苗。所述疫苗可以为核酸疫苗，其中包含编码OBSCN新抗原表位肽的核酸序列，如DNA疫苗或RNA疫苗。或者，所述疫苗为重组蛋白疫苗、合成多肽疫苗、混合肽池(peptidepool)疫苗等，其中包含OBSCN新抗原表位肽序列。或者，所述疫苗为细胞疫苗，其中包含抗原提呈细胞(如树突细胞)，所述抗原提呈细胞包含OBSCN新抗原表位肽序列。[0022] 具体的，所述药物为可以预防和/或治疗OBSCNV327L突变或A1348V突变阳性表达的肿瘤的细胞制剂。所述细胞制剂包含经修饰的细胞，包括但不限于包含T细胞抗原受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)或其编码核酸的T细胞、NK细胞、CIK细胞、肿瘤浸润淋巴细胞，所述T细胞抗原受体或嵌合抗原受体能够特异性识别OBSCN新抗原表位。[0023] 作为本发明一种优选的实施方案，所述OBSCN新抗原表位肽可以采用化学合成法制备，包括但不限于固相合成法、液相合成法、固?液相合成法。合成策略包括C?端合成、N?端合成、分段合成等，并且在C?端或N?端可以进行常规修饰，使其包含修饰基团。[0024] 作为本发明一种优选的实施方案，所述肿瘤为OBSCN新抗原阳性表达的肿瘤，包括恶性肿瘤。[0025] 具体的，所述肿瘤包括但不限于子宫内膜癌、肝细胞癌、结肠腺癌、直肠腺癌、胰腺癌、肺腺癌、食管癌、乳腺癌、低级别脑胶质瘤、肾乳头状细胞癌、结内帕利沙肌成纤维母细胞瘤、神经肌肉迷行瘤、硬纤维瘤、青少年血管纤维瘤、牙釉质型颅咽管癌、肝母细胞瘤、胰腺导管癌、胆道癌、脑血管瘤、皮肤默克尔细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、原位黑色素瘤、皮肤基底细胞癌。[0026] 一种预防和/或治疗肿瘤的药物，所述药物包含以下一种或多种：[0027] (1)OBSCN新抗原表位肽序列；[0028] (2)编码OBSCN新抗原表位肽的核酸序列；[0029] (3)特异性识别OBSCN新抗原表位的T细胞抗原受体或嵌合抗原受体或其编码核酸。[0030] 作为本发明一种优选的实施方案，所述药物为生物制品，包括预防用或治疗用生物制品，如疫苗、细胞制剂等。[0031] 具体的，所述药物为可以诱导机体产生特异性的针对具有OBSCNV327L突变或A1348V突变的肿瘤的细胞毒性T细胞克隆的疫苗。所述疫苗包括但不限于核酸疫苗(如DNA、RNA疫苗，其中包含编码OBSCN新抗原表位肽的核酸序列)、重组蛋白疫苗、合成多肽疫苗、混合肽池疫苗(其中包含OBSCN新抗原表位肽序列)、细胞疫苗(其中包含抗原提呈细胞，抗原提呈细胞包含OBSCN新抗原表位肽序列)。[0032] 具体的，所述药物为可以预防和/或治疗OBSCNV327L突变或A1348V突变阳性表达的肿瘤的细胞制剂。所述细胞制剂包含经修饰的细胞，包括但不限于包含T细胞抗原受体或嵌合抗原受体或其编码核酸的T细胞、NK细胞、CIK细胞、肿瘤浸润淋巴细胞，其中T细胞抗原受体或嵌合抗原受体能够特异性识别OBSCN新抗原表位。[0033] 作为本发明一种优选的实施方案，所述药物为疫苗时，还可以包括免疫调节剂或佐剂，包括但不限于聚?ICLC(poly?ICLC)、1018ISS、Amplivax、MF59、AS03、AS04、AS15、BCG、CP?870、CP?893、CpG7909、CyaA、环二核苷酸(如STING)、dSLIM、GM?CSF、IL?2、IC30、IC31、TMMontanideISA (如MontanideISA51)。[0034] 作为本发明一种优选的实施方案，所述药物的剂型为药剂学上可接受的剂型，包括但不限于粉针剂、注射液、喷雾剂、分散液。[0035] 作为本发明一种优选的实施方案，所述药物的给药途径为药剂学上可接受的途径，包括但不限于皮内、皮下、肌内、静脉内，以及经鼻内或口腔吸入。[0036] 作为本发明一种优选的实施方案，所述药物还包括药剂学上可接受的载体或辅料，包括但不限于溶剂、增溶剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、调节渗透压的盐、缓冲剂。[0037] 作为本发明一种优选的实施方案，所述药物的剂量为药剂学上可接受的剂量。[0038] 本发明的有益效果：[0039] 本发明提供的OBSCN新抗原表位肽(氨基酸序列如SEQIDNO：1?4所示)能够有效刺激并诱导产生特异性的细胞毒性T淋巴细胞，杀伤新抗原阳性表达的肿瘤细胞。由于该抗原表位患者覆盖率高，将其制成预防和/或治疗肿瘤的药物(如疫苗、细胞制剂等)具有良好的治疗潜力和应用前景。[0040] 本发明提供的预防和/或治疗肿瘤的药物包含OBSCN新抗原表位肽或其编码核酸、或者特异性识别OBSCN新抗原表位的T细胞抗原受体或嵌合抗原受体或其编码核酸，其能在+体内外诱导产生具有肿瘤杀伤功能的突变表位肽特异性的CD8 T淋巴细胞，具有较高的临床应用价值。附图说明[0041] 图1为实验例在健康志愿者中突变表位肽诱导产生的T淋巴细胞分泌IFN?γ的情况。[0042] 图2为在健康志愿者中突变表位肽诱导产生的T淋巴细胞中分泌IFN?γ的CD8+T淋巴细胞的情况。[0043] 图3为在健康志愿者中突变表位肽诱导产生的T淋巴细胞中分泌granzymeB的CD8+T淋巴细胞的情况。[0044] 图4为在乳腺癌患者中突变表位肽诱导产生的T淋巴细胞中分泌IFN?γ的CD8+T淋巴细胞的情况。[0045] 图5为在乳腺癌患者中突变表位肽诱导产生的T淋巴细胞中分泌granzymeB的CD8+T淋巴细胞的情况。[0046] 图6为在健康志愿者中突变表位肽诱导产生的T淋巴细胞杀伤靶细胞的情况。[0047] 附图中涉及的显著性分析标识，*表示p＜0.05、**表示p＜0.01、***表示p＜0.001。[0048] 为了更清楚地说明本发明所要保护的技术方案，以上对实施例或实验例中的附图进行简单地介绍。应当理解，上述附图不应看作是对本发明保护范围的任何限制。对于本领域的普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图得到其他相关的附图。具体实施方式[0049] 下面将结合具体实施例和实验例对本发明的技术方案进行清楚、完整地说明。[0050] 本领域技术人员应当理解，下述的实施例和实验例仅用于说明本发明的技术方案和技术效果，不应看作是对本发明保护范围的任何限制。基于下述实施例，本领域技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他技术方案，例如修改、变形或简单替换后得到的技术方案，均属于本发明的保护范围。[0051] 实施例或实验例中使用的原料、试剂、设备等，如无特殊说明，均为市售商品。[0052] 实施例1[0053] 本实施例提供一种OBSCN新抗原表位肽，包含OBSCNV327L突变，其氨基酸序列如下所示：[0054] OBSCNV327L(10aa)：VLV[L]VREPAV(SEQIDNO：3)。[0055] 本实施例还提供一种经密码子优化的、且能编码上述OBSCN新抗原表位肽的核酸。[0056] 实施例2[0057] 本实施例提供一种OBSCN新抗原表位肽，包含OBSCNA1348V突变，其氨基酸序列如下所示：[0058] OBSCNA1348V(10aa)：FHLDVSEPK[V](SEQIDNO：4)。[0059] 本实施例还提供一种经密码子优化的、且能编码上述OBSCN新抗原表位肽的核酸。[0060] 实施例3[0061] 本实施例提供一种OBSCN新抗原表位肽或其编码核酸(同实施例1)在制备预防和/治疗肿瘤的药物中的应用。[0062] 本实施例还提供一种预防肿瘤的药物，所述药物为mRNA疫苗，其中包含药效量的、且由脂质纳米颗粒(LNP)递送的mRNA(同实施例1，且经密码子优化)，以及适量的佐剂和辅料。[0063] 本实施例还提供一种预防肿瘤的药物，所述药物为合成多肽疫苗，其中包含药效量的、且采用Fmoc固相合成法制备的OBSCN新抗原表位肽(如SEQIDNO：3所示)，以及适量的佐剂和辅料。[0064] 实施例4[0065] 本实施例提供一种OBSCN新抗原表位肽或其编码核酸(同实施例2)在制备预防和/治疗肿瘤的药物中的应用。[0066] 本实施例还提供一种预防肿瘤的药物，所述药物为mRNA疫苗，其中包含药效量的、且由脂质纳米颗粒(LNP)递送的mRNA(同实施例2，且经密码子优化)，以及适量的佐剂和辅料。[0067] 本实施例还提供一种预防肿瘤的药物，所述药物为混合肽池疫苗，其中包含药效量的、且采用Fmoc固相合成法制备的OBSCN新抗原表位肽(如SEQIDNO：3和4所示)，以及适量的佐剂和辅料。[0068] 实施例5[0069] 本实施例提供一种治疗肿瘤的药物，所述药物为细胞制剂，其中包含药效量的、且能特异性识别OBSCN新抗原表位(同实施例2中OBSCN新抗原表位肽所含抗原表位)的CAR?T细胞，以及适量的佐剂和辅料。[0070] 实验例1[0071] 1、新抗原表位肽的筛选与合成[0072] (1)从TheCancerGenomeAtlas(TCGA)队列下载数据[0073] 使用来自TheCancerGenomeAtlas(TCGA)的体细胞错义突变数据对乳腺癌的突变景观进行审查。与此同时，RNA测序数据揭示了肿瘤微环境中的免疫细胞浸润情况。综合数据集，包括突变概况、基因表达数据以及相关的临床信息(均从TCGA数据门户https://portal.gdc.com中获。刂2021年10月3日)，分析涵盖来自1101名乳腺癌患者和113例配对的相邻正常乳腺组织样本的数据，突变数据使用R软件中的maftools包进行下载和可视化。[0074] (2)乳腺癌患者共享的肿瘤特异性体细胞突变[0075] 选择最常见的非同义突变作为“具有突变位点的基因”字段中的选项，每种突变的频率由以下公式计算：突变频率＝错义突变的样本数/总样本数。[0076] (3)候选抗原表位肽的预测和合成[0077] 通过使用不同算法，使用4个程序进行潜在抗原表位的预测：IEDB、NetMHC4.0、NetCTL1.2和SYFPEITHI，目的是识别与人类高频HLA?A*02亚型具有结合潜力的8?11个氨基酸的肽段，具体包括A*0201、A*0203、A*0206和A*6802。HLA?A2单体在中国人口中的普遍+性为37.7％，据此确定HLA?A2限制的CD8CTL新抗原表位。该表位肽通过标准实验室技术合成，经电喷雾质谱法进行纯化和确认，之后以pH7.2的磷酸盐缓冲液溶解，最终浓度为10mg/mL。[0078] 2、新抗原表位肽的筛选结果[0079] (1)乳腺癌样本中频率较高的基因突变位点[0080] 体细胞错义突变被认为是癌细胞内新抗原(或新表位)的主要起源，因此对在乳腺癌中高频发生的错义突变进行全面计算和分析，并使用包含在第11位位置含有突变氨基酸的21?mer肽段进行展示。[0081] 结果显示，经常发生突变的位点与现有文献中常见报道的热点突变一致。将已识别的频率估计大于1％的错义突变添加到错义突变列表中，详见表1。[0082] 表1乳腺癌样本中高频突变位点及其突变频率[0083][0084][0085] (2)与HLA?A2分子结合的潜在新表位的筛选结果[0086] 设计针对人类高频HLA?A类I基因产物的8?10个氨基酸的肽段，目标亚型为HLA?A*02(A*0201、A*0203、A*6802和A*0206)，使用四个不同算法程序进行预测，包括IEDB、NetMHC4.0、NetCTL1.2和SYFPEITHI。设计过程需要考虑蛋白酶体C?末端裂解、与抗原处理相关的转运体(TAP)的运输效率以及肽?HLA类I分子的半解离时间等因素。对表位预测分析中获得的结果进行排名，NetMHC4.0(IC50＜500nM)作为主要工具，同时得到其他程序的支持，详见表2。[0087] 表2乳腺癌高频突变位点新表位的预测评分[0088][0089] 实验例2[0090] 1、新表位/HLA?A2分子复合物的结合亲和力[0091] 通过标准实验室技术合成预测的新表位，并评估其与HLA?A2转基因T2(T2A2)细胞的结合亲和力。[0092] 结合力实验方案如下：[0093] (1)将所制备的候选肽溶解在PBS(pH7.2)中，配制成1mg/mL，于?80℃冷藏备用。[0094] (2)获取生长状态良好的T2细胞，4℃、2000rpm离心10min，用无血清IMDM培养基洗6涤2次，之后调密度至2×10个/mL，铺于24孔板中，1mL/孔。[0095] (3)将溶解好的肽放入4℃冰箱解冻，铺板后先加入人β2微球蛋白(β2?M)(浓度0.5μg/mL)，再加入溶解好的抗原肽(50μg/mL)。[0096] 设计不同的组别：实验组、阴性对照组(PBS)、阳性对照组(COX?2321?329)和背景组(T2A2细胞)，于37℃细胞培养箱中孵育18h。[0097] (4)收集孵育18h后的细胞于1.5mLEP管中，4℃、2000rpm离心10min，加入预冷后的PBA缓冲液(含2％小牛血清和适量NaN3)洗涤两次。[0098] (5)弃上清后，4℃避光孵育HLA?A2抗体30min，吹洗混匀。[0099] (6)孵育结束，直接加入1mLPBA缓冲液洗涤，4℃、3000rpm离心10min，弃上清，补加200μL预冷的PBA缓冲液，流式细胞仪进行检测。[0100] (7)荧光指数FI计算公式如下：FI＝(实验组MFI?背景组MFI)/背景组MFI。FI值代表抗原表位肽与HLA?A2分子的结合能力，实验结果详见表3。[0101] 表3筛选的表位肽与HLA?A2的结合亲和力[0102][0103] FIa＝(MFI ofthegivenpeptide?MFI ofthe PBS controlgroupwithoutpeptides)/MFIofthePBScontrol[0104] groupwithoutpeptides.[0105] 从表3可以看出，来自OBSCNV327L和OBSCNA1348V突变位点的两个MUT新表位表现出较高的结合亲和力(FI＞1)。其余的新表位肽表现出较弱的结合亲和力(FI＜0.5，未显示数据)。因此，选择OBSCNV327L和OBSCNA1348V突变表位肽进行下一步的免疫学活性验证。[0106] 2、诱导人外周血单个核细胞(PBMCs)[0107] 实验方案如下：[0108] (1)对健康人或者乳腺癌病人外周血进行HLA?A2型别鉴定，鉴定后的HLA?A2志愿者分别抽取40mL外周血。[0109] (2)将抽取的外周血与pH7.2的PBS按照1:1的比例混匀稀释，取50mL离心管，向离心管中加入15mL分离液，再加入30mL稀释后的外周血，2000rpm离心30min，可见离心管中自上而下分为4层：血浆层、淋巴细胞层、分离液层和红细胞层。[0110] (3)另准备40mL离心管，每管中加入30mLpH7.2的PBS(pH7.2)，小心吸取“白膜层”单个核细胞于离心管中，离心洗涤2次：2000rpm，20min。[0111] (4)诱导CTL：通过上述密度梯度离心法已经分离出HLA?A2+健康或者结直肠癌病人捐赠者的外周血单个核细胞，用GT?T551培养基重悬细胞，调整细胞密度1?1.5×610cells/mL，按照5mL/孔铺于6孔板中，于37℃、5％CO2细胞培养箱中静置4h，之后缓慢吸取孔板上清中的非粘附细胞(外周血淋巴细胞)，将其收集并冻存于液氮中，冻存密度为1×710cells/mL，以便后续与成熟的自体DCs孵化。[0112] 在剩下的孔板中补加含有胎牛血清的IMDM培养基，并加入1000U/mLGM?CSF和1000U/mLIL?4细胞因子，诱导6孔板中的粘附细胞分化为树突状细胞，之后每2天进行半量换液并补充相应的细胞因子，在第5天加入100ng/mL的LPS诱导DC成熟。[0113] (5)在诱导成熟的树突状细胞中加入表位肽50μg/mL，孵育24h，将用表位肽脉冲过的DC与之前冻在液氮里的自体外周血淋巴细胞(PeripheralBloodLymphocyte，PBL)以DC：PBL＝1:10的比例培养在6孔板中，用含10％胎牛血清的RPMI?1640完全培养基培养，并加入100U/mLrhIL?2和10ng/mLrhIL?7，每2天半量换液一次，补充相应的细胞因子，一周后用表位肽再次脉冲自体DCs重新刺激PBLs，三轮刺激后，收集诱导的细胞毒性T淋巴细胞，进行下一步的功能分析。[0114] 3、ELISPOT法检测新表位体外特异性CTL分泌IFN?γ的能力[0115] 实验方案如下：[0116] (1)预包被板的活化：取出所需ELISPOT板条，每孔加200μL无血清的IMDM培养基进行封闭，静置10min后将培养基弃去。[0117] (2)细胞铺板：上述诱导的CTL作为效应细胞，荷肽的T2A2作为刺激细胞，将细胞浓6度均调整为2×10个/mL，设置各孔加量：[0118] 实验孔：每孔加50μL效应细胞和50μL刺激细胞；[0119] 阴性对照孔：每孔加100μL无血清的IMDM培养基；[0120] 阳性对照孔：每孔加50μL的效应细胞和10μLPHA，再补加40μL无血清的IMDM培养基。[0121] 铺板完毕放于培养箱中，37℃、5％CO2孵育18h。[0122] (3)细胞裂解：孵育结束后，倾尽孔中培养基，每孔加入200μL无菌的去离子水，4℃裂解细胞10min，再倾尽孔内液体，加入200μL1×WashingBuffer进行洗涤，洗涤6次，每次停留60s，洗涤完毕，在吸水纸上拍干。[0123] (4)加入检测抗体孵育：加入100μL生物素标记的抗体，37℃孵育1h，孵育完成，倾尽孔内液体，加入200μL1×WashingBuffer进行洗涤，洗涤6次，每次停留60s，洗涤完毕，在吸水纸上拍干。[0124] (5)加入酶联亲和素孵育：加入100μL酶联亲和素，37℃孵育1h，孵育完成，倾尽孔内液体，每孔加入200μL1×WashingBuffer进行洗涤，洗涤6次，每次停留60s，洗涤完毕，在吸水纸上拍干。[0125] (6)显色：加入100μL现配的AEC显色液，室温(25℃)避光静置30min，进行显色，显色完成后，倾尽孔内液体并打开孔板底座，用去离子水洗涤，终止显色，置于通风处，室温静置干燥，之后用ELISPOT图像分析仪计数孔板中每孔的斑点数，结果比较如图1所示。[0126] 从图1可以看出，在健康志愿者中突变表位肽诱导产生的T淋巴细胞中能分泌更多的IFN?γ。[0127] 4、胞内因子染色实验[0128] (1)靶细胞准备：收集T2细胞密度调整为2×106个/mL，铺入24孔板，以3μg/mL加入β2?M，以50μg/mL加入表位肽，37℃、5％CO2条件下孵育4h。[0129] (2)靶细胞与诱导后的T细胞共孵育：分别将500μL荷肽的T2或转染后的肿瘤细胞与CTL加入1.5mLEP管中，37℃、5％CO2条件下共孵育4h，设置对照组、PBS组、CD3单阳组、CD8单阳组、同型对照组、阳性对照PHA组和实验组，共孵育后加入阻断剂BFA抑制CTLs胞内因子向外分泌。[0130] (3)孵育CD3和CD8抗体，混匀后于4℃避光孵育30min，加入200μLfixationbuffer重悬细胞，室温避光静置30min，再加入200μL1×破膜剂，1500rpm离心3min，之后重复操作一次。[0131] (4)孵育胞内因子抗体：加入100μL1×破膜剂(重悬细胞)和适量的PEMouseAnti?HumanIFN?γ、granzymeB、Perforin抗体，4℃避光孵育30min，抗体孵育结束后加入FACSbuffer1500rpm离心3min洗涤一次，之后加入FACSbuffer重悬细胞，流式细胞仪上机检测，结果比较如图2?5所示。[0132] 从图2可以看出，在健康志愿者中突变表位肽诱导产生的T淋巴细胞中具有更多的+分泌IFN?γ的CD8T淋巴细胞。[0133] 从图3可以看出，在健康志愿者中突变表位肽诱导产生的T淋巴细胞中具有更多的+分泌granzymeB的CD8T淋巴细胞。[0134] 从图4可以看出，在乳腺癌患者中突变表位肽诱导产生的T淋巴细胞中具有更多的+分泌IFN?γ的CD8T淋巴细胞。[0135] 从图5可以看出，在乳腺癌患者中突变表位肽诱导产生的T淋巴细胞中具有更多的+分泌granzymeB的CD8T淋巴细胞。[0136] 5、细胞毒活性实验检测体外诱导CTLs对靶细胞的杀伤[0137] (1)靶细胞、效应细胞的准备[0138] 将空载或者荷肽T2A2的细胞作为靶细胞，调整细胞密度为1×105个/mL，每孔加入5000个/50μL，加入不同数量和体积的效应细胞，使实验组形成不同的效靶比，分别为12.5:1、25:1、50:1，并补加无血清的IMDM培养基至总体积为100μL，每组设置3个复孔，同时设置以下对照组：靶细胞自发释放组、靶细胞最大释放组、效应细胞自发释放组、背景对照组和总体积校正对照组，各对照组也设置3个复孔，每孔总体积为100μL。[0139] (2)LDH检测[0140] 将96孔细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养4h，结束前45min在靶细胞最大释放孔和体积校正孔中加入10μL10×裂解液，培养结束后，1000rpm离心培养板10min，取出，每孔轻轻吸取50μL上清于另一96孔板对应的孔中，全部转移结束，每孔迅速加入50μL乳酸脱氢酶底物混合液，室温避光孵育30min，孵育结束后，每孔添加50μL终止液，于酶标仪上以490nm检测吸收OD值，杀伤率计算公式如下：杀伤率＝(实验组释放?效应细胞自发释放?靶细胞自发释放)/(靶细胞最大释放?靶细胞自发释放)×100％，结果如图6所示。[0141] 从图6可以看出，在健康志愿者中突变表位肽诱导产生的T淋巴细胞具有更好的杀伤靶细胞的能力。[0142] 以上实验结果表明，本发明提供的OBSCN新抗原表位肽(氨基酸序列如SEQIDNO：1?4所示)能够有效刺激并诱导产生特异性的细胞毒性T淋巴细胞，杀伤新抗原阳性表达的肿瘤细胞。由于该抗原表位患者覆盖率高，将其制成预防和/或治疗肿瘤的药物(如疫苗、细胞制剂等)具有良好的治疗潜力和应用前景。[0143] 虽然上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实验例对本发明的技术方案做了详尽的描述，但需要说明的是，实施例和实验例仅用于说明本发明的技术方案和技术效果，而不应视为对本发明保护范围的任何限制。基于本发明技术构思所做的简单变形、修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

专利地区：河南

专利申请日期：2024-02-29

专利公开日期：2024-08-30

专利公告号：CN118085058B