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专利名称：林蛙抗菌肽浓缩液在制备抗支原体的药物中的应用

专利类型：实用新型专利

专利申请号：CN202410186225.4

专利申请（专利权）人：通化康元生物开云优惠体育网页版入口有限公司
权利人地址：吉林省通化市通化开发区经开环路2266号

专利发明（设计）人：林万君,郑玲玲,林东明,高梅,高凌

专利摘要：本申请提供了林蛙抗菌肽浓缩液在制备抗支原体药物中的应用，所述林蛙抗菌肽浓缩液是通过将林蛙干体酶解制备获得的。林蛙抗菌肽浓缩液以及其中的具体级分和肽具有显著的抗支原体效果，为治疗支原体感染类疾病提供了一类新的药物选择。

主权利要求：
1.林蛙抗菌肽，其特征在于，所述林蛙抗菌肽的氨基酸序列为KLPWIV或者QKPHTPW。
2.根据权利要求1所述的林蛙抗菌肽在制备抗肺炎支原体的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其中所述药物为液体制剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其中所述药物为口服制剂或外用制剂。 说明书 : 林蛙抗菌肽浓缩液在制备抗支原体的药物中的应用技术领域[0001] 本申请属于抗感染领域，具体地，本申请提供了林蛙抗菌肽浓缩液在制备抗支原体的药物中的应用。背景技术[0002] 支原体广泛存在于自然界和人体中，多数支原体对人并不致病。但肺炎支原体、生殖支原体、解脲脲原体等支原体引起的呼吸系统、泌尿系统、生殖系统感染也是临床上常见的疾病。[0003] 支原体感染疾病尚无疫苗可用于预防，少量临床上可用的药物如喹诺酮类药物、大环内酯类药物、多西环素类药物均是在抗细菌药物基础上开发的新用途，效果并不显著。因此，临床上经常采用等待自愈的方式处置支原体感染。[0004] 东北林蛙(Ranadybowskii)是我国特有的重要药食两用两栖动物，其药用历史悠久，早在明代李时珍《本草纲目》中便有记载。已有研究表明，东北林蛙皮分泌物由多种组分组成，其皮肤分泌物抗菌肽粗提物具有广谱的抗菌活性。从林蛙这一资源中寻找抗支原体药物是一个有潜力的方向。发明内容[0005] 申请人在深度开发林蛙资源的过程中，通过酶解、超声等方式制备了林蛙抗菌肽浓缩液，证明了其具有抗多种细菌和病毒的作用，并从其中鉴定了多种具体抗菌、抗氧化等作用的具体肽序列。[0006] 一方面，本申请提供了林蛙抗菌肽浓缩液在制备抗支原体药物中的应用。[0007] 另一方面，本申请提供了林蛙抗菌肽浓缩液在制备灭杀支原体的消毒剂中的应用。[0008] 进一步地，所述林蛙抗菌肽浓缩液是通过将林蛙干体酶解制备获得的。[0009] 进一步地，所述林蛙抗菌肽浓缩液的制备方法包括：[0010] (1)取林蛙干体为原料；[0011] (2)将林蛙干体加入10倍林蛙干体重量的8wt％醋酸水溶液中，所述8wt％醋酸水溶液中包含2000U/mg林蛙干体的木瓜蛋白酶，10℃下溶胀、酶解2小时，灭酶，制得粗提物；[0012] (3)将步骤(2)获得的粗提物，在功率为100W，频率为20kHz超声波发生器内进行超声辅助提取40分钟，过滤，得提取液；[0013] (4)取步骤(3)获得提取液，在300prm下离心20min，弃去沉淀，收集上清液；[0014] (5)将(4)获得的上清液在40℃温度下处理15min，降至5?10℃，过滤并将滤液浓缩至比重为1.1?1.2，得林蛙抗菌肽浓缩液。[0015] 进一步地，所述林蛙抗菌肽浓缩液的制备方法还包括：[0016] (6)对步骤(5)获得林蛙抗菌肽浓缩液超滤，取分子量<3kDa的部分。[0017] 另一方面，本申请提供了林蛙抗菌肽，所述林蛙抗菌肽的氨基酸序列为KLPWIV或者QKPHTPW。[0018] 另一方面，本申请提供了上述林蛙抗菌肽在制备抗支原体药物中的应用。[0019] 进一步地，所述药物为液体制剂。[0020] 进一步地，所述药物为口服制剂或外用制剂。[0021] 进一步地，所述支原体为肺炎支原体。[0022] 由于支原体在细胞膜等结构上的共性，本领域技术人员可以预期除肺炎支原体外，本申请的药物还可以用于生殖支原体、解脲脲原体、人支原体等支原体种类。[0023] 进一步地，所述药物中包含药学上可接受的辅料。[0024] 本申请的药物优选口服或外用的液体制剂，其中的辅料本领域技术人员可以根据药剂领域一般知识常规确定，辅料包括但不限于溶剂、助溶剂、抗氧化剂、pH调节剂、渗透压调节剂、稳定剂、渗透促进剂。[0025] 本申请的药物中不排斥其他抗支原体药物，包括但不限于喹诺酮类药物、大环内酯类药物、多西环素类药物。[0026] 本申请的林蛙抗菌肽浓缩液使用可食用的林蛙为原料，以食品用酶酶解获得，具备良好的安全性。鉴定出的多肽具备良好的抗消化性能和生物活性，有潜力开发为临床可用的药物、消毒剂等产品。附图说明[0027] 图1为抗菌肽浓缩液抗支原体活性检测开云优惠体育网页版入口；[0028] 图2为肽KLPWIV的质谱图；[0029] 图3为肽QKPHTPW的质谱图。具体实施方式[0030] 实施例1基本检测方法[0031] 抗支原体活性检测委托英格尔检测技术服务(上海)有限公司进行，参照《消毒技术规范》2022版2.1.1.7节进行：[0032] 将0.5mL支原体(肺炎支原体)悬液(1×108CFU/mL)与4.5mL待测液/生理盐水混合后静置20min；吸取0.5mL混合液梯度稀释后培养并测试和反推混合液支原体CFU值；计算抑制率/灭杀率。[0033] 实施例2林蛙抗菌肽浓缩液的制备[0034] 林蛙抗菌肽浓缩液的制备方法与先前申请中所述基本相同：[0035] (1)取林蛙干体为原料；[0036] (2)将林蛙干体加入10倍林蛙干体重量的8wt％醋酸水溶液中，所述8wt％醋酸水溶液中包含2000U/mg林蛙干体的木瓜蛋白酶，10℃下溶胀、酶解2小时，灭酶，制得粗提物；[0037] (3)将步骤(2)获得的粗提物，在功率为100W，频率为20kHz超声波发生器内进行超声辅助提取40分钟，过滤，得提取液；[0038] (4)取步骤(3)获得提取液，在300prm下离心20min，弃去沉淀，收集上清液；[0039] (5)将(4)获得的上清液在40℃温度下处理15min，降至5?10℃，过滤并将滤液浓缩至比重为1.1?1.2，得林蛙抗菌肽浓缩液。[0040] 实施例3林蛙抗菌肽浓缩液的抗支原体性能分析[0041] 如图1所示，直接使用实施例1的林蛙抗菌肽浓缩液获得了100％抑制率的数据，说明了林蛙抗菌肽浓缩液具有作为抗支原体药物的潜力。[0042] 考虑到实际使用时的浓度问题，我们对实施例1的林蛙抗菌肽浓缩液稀释后进行抗支原体测试，结果如表1所示：[0043] 表1林蛙抗菌肽浓缩液稀释后的抗支原体效果[0044][0045] 结果表明，实施例1的林蛙抗菌肽浓缩液在稀释后抗支原体效果迅速降低，在10倍以上已经基本没有抗支原体作用。[0046] 为了探究浓缩液中的抗支原体有效成分，申请人通过milipore超滤膜超滤从林蛙抗菌肽浓缩液获得<3kDa级分，3?5KDa级分，5?10KDa级分以及>10Da级分分别进行抗支原体测试，结果如表2所示：[0047] 表2林蛙抗菌肽浓缩液不同级分的抗支原体效果[0048][0049] 结果表明，主要抗支原体成分存在于<3kDa级分中，为小蛋白/蛋白片段/短肽类成分。[0050] 实施例4进一步鉴定林蛙抗菌肽浓缩液中的有效成分[0051] 肽的鉴定[0052] 取实施例3中的<3kDa级分；以C18除盐柱进行除盐；经由配备分析柱AcclaimPepMapC18的LC?MS/MS分析(A相：0.1％甲酸水溶液，B相：含0.1％甲酸的80％的ACN溶液；从5％的B相起始，升高到40％，进而升高到100％)。串联质谱图经过PEAKSStudio分析；对uniprot?Vigna数据库搜库，肽段卡值为：?10lgP≥20；通过ToxinPrep对肽进行毒性预测；通过PeptideRanker预测肽的活性；通过PeptideCutter基于胃蛋白酶和胰蛋白酶对肽进行胃肠道消化性预测。选择无毒、高生物活性(阈值大于0.5)和不消化的肽。[0053] 获得两条可能具有抗支原体活性和实用潜力的肽，序列为：[0054] SEQIDNO.1：KLPWIV；[0055] SEQIDNO.2：QKPHTPW。[0056] 实施例5两种多肽的合成[0057] 委托南京金斯瑞使用固相法合成上述多肽，基本过程包括：[0058] (1)DMF溶胀活化Wang树脂；[0059] (2)接第一个氨基酸；[0060] (3)Fmoc保护基脱除；[0061] (4)接第二个氨基酸并脱除Fmoc保护基；[0062] (5)重复步骤(4)多次，直到合成到最后一个氨基酸并脱除Fmoc保护基；[0063] (7)树脂的脱落及纯品分离；[0064] (8)使用质谱检测，通过分子量验证。[0065] 合成的两个肽的质谱检测图如图2和图3所示[0066] 实施例6合成肽的性质测定[0067] 按照0.05mg/mL的浓度配制两种肽溶液样品(使用实施例2的林蛙抗菌肽浓缩液制备冻干粉，配制0.2mg/mL的溶液作为比较)，对上述三种溶液进行抗支原体测试，结果如表3所示：[0068] 表3多肽溶液的的抗支原体效果[0069][0070][0071] 结果表明，两种肽在较低的浓度下也可以实现良好的抗支原体效果，相比而言林蛙抗菌肽浓缩液冻干粉溶液虽然浓度已经是肽溶液的4倍，但抗支原体效果仍然不明显。

专利地区：吉林

专利申请日期：2024-02-20

专利公开日期：2024-08-27

专利公告号：CN118045161B