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专利名称：一种人载脂蛋白A-I的分离纯化方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410208909.X

专利申请（专利权）人：武汉鹰达生物开云优惠体育网页版入口有限公司
权利人地址：湖北省鄂州市葛店开发区高新二路与发展大道交汇处光谷联合开云优惠体育网页版入口城2.1期B9B10工程B9-3厂房1-4层2号

专利发明（设计）人：贾海波,汪玉宝,朱文武,韩强,杨盼春

专利摘要：本发明提出了一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，具体包括如下步骤：S1、将冻融处理后的血清样本进行离心、过滤得到澄清样本；S2、将步骤S1得到的澄清样本依次进行除脂、亲和层析后得到不同纯度的蛋白洗脱液；S3、将步骤S2得到的不同纯度的蛋白洗脱液混合后进行后处理后得到人载脂蛋白A?I，与现有技术相比，本发明对血清进行冻融和过滤处理，然后对上清液进行除脂，从而排除会对亲和层析产生干扰的物质，然后对除脂后的上清液体系进行亲和层析，并进行洗脱等后处理，从而获得了高浓度、高含量的人载脂蛋白A?I的产品，通过该分离纯化步骤，最终得到的产物纯度高，同时含量也更高，纯化步骤易于进行更大规模的生产，且亲和层析用到的设备易于维护。

主权利要求：
1.一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法具体包括如下步骤：S1、将冻融处理后的血清样本进行离心、过滤得到澄清样本；
S2、将步骤S1得到的澄清样本依次进行除脂、亲和层析后得到不同纯度的蛋白洗脱液；
S3、将步骤S2得到的不同纯度的蛋白洗脱液混合后进行后处理后得到人载脂蛋白A?I；
所述步骤S2中，所述亲和层析采用配体亲和层析，所述配体亲和层析的具体步骤如下：将除脂后的样本进行透析和过滤后，加入到配体亲和层析柱中，在25?30℃下用缓冲液淋洗至基线，用洗脱液洗脱，得到不同纯度的蛋白洗脱液；
所述配体亲和层析柱的制备方法具体包括如下步骤：
A1、将罗非鱼Ig单克隆抗体在偶联缓冲液中进行透析；
A2、将固相配体支持物加入到层析柱中，然后将经过步骤S1透析后的罗非鱼Ig单克隆抗体加入到层析柱中，静置12h；
A3、用偶联缓冲液冲洗层析柱；
A4、在冲洗后的层析柱中加入封闭缓冲液；
A5、依次用碱性缓冲液、酸性缓冲液和偶联缓冲液清洗层析柱；
A6、将层析柱用过柱缓冲液浸泡，得到亲和层析柱；
所述步骤A1、A3和A5中，偶联缓冲液均为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且所述Tris?HCl体系中含有0.05MNaCl；
所述步骤A2中，固相配体支持物为琼脂多糖4B；
所述步骤A5中，碱性缓冲液包括如下组分：0.2M的NaHCO3和0.05M的NaCl，且所述碱性缓冲液的pH为8.3；
酸性缓冲液为pH为6.0、质量浓度为0.1M的柠檬酸体系，且所述柠檬酸体系中含有
0.05MNaCl。
2.如权利要求1所述的人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中，冻融处理具体包括如下步骤：将待处理的血清样本在?20至?80℃条件下冷冻得到冷冻样本，冷冻时间≥24h；将得到的冷冻样本置于2?8℃条件下解冻得到血清样本。
3.如权利要求1所述的人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中，离心处理的参数如下：转速为7000?9000rpm，时间为15?25min。
4.如权利要求1所述的人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S2中，除脂的具体步骤如下：在25?30℃条件下，在步骤S1得到的澄清样本中加入沉淀剂，搅拌均匀后进行离心处理，得到上清液。
5.如权利要求4所述的人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，其特征在于，所述沉淀剂为质量浓度为1.5?2.5％的磷钨酸?镁溶液，离心处理的参数如下：转速为7000?9000rpm，时间为
10?20min。
6.如权利要求1所述的人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，其特征在于，所述缓冲液为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且所述Tris?HCl体系中含有0.1MNaCl，所述洗脱液为pH为6?7、质量浓度为0.1M的吐温20水溶液体系，且所述吐温20水溶液体系中的pH调节剂为柠檬酸。
7.如权利要求1所述的人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，其特征在于，所述透析的透析体系如下：透析膜为孔径为10kDa的半透膜，透析液为质量浓度为0.05％、pH为6?7的吐温20水溶液。 说明书 : 一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法技术领域[0001] 本发明涉及一种生物分离工程领域，尤其设计一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法。背景技术[0002] 人血浆人载脂蛋白A?I作为高密度脂蛋白的主要载脂蛋白成份，分子量为28kDa，由243个氨基酸组成，等电点5.6左右。高密度脂蛋白在血浆中浓度约为3g/L。高密度脂蛋白运载周围组织中的胆固醇，再转化为胆汁酸或直接通过胆汁从肠道排出，动脉造影证明高密度脂蛋白胆固醇含量与动脉管腔狭窄程度呈显著的负相关。所以高密度脂蛋白是一种抗动脉粥样硬化的血浆脂蛋白，是冠心病的保护因子。俗称“血管清道夫”。在胆固醇从外周逆向转运如肝脏降解或者循环的过程中，人载脂蛋白A?I起着关键作用，是高密度脂蛋白具有抗动脉粥样硬化的主要作用机制承担者。所以人载脂蛋白A?I具有很好的抗动脉粥样硬化应用潜力，尤其是在拥有庞大人口的中国，受动脉粥样硬化困扰的人们越来越多，人载脂蛋白A?I将会有巨大的临床应用价值。[0003] 在其他脂蛋白中，ApoA?I含量极低，可以反映HDL的水平，与高密度脂蛋白胆固醇(Highdensitylipoproteincholesterol，HDL?C)的水平呈明显正相关。医学研究表明，HDL的水平与动脉粥样硬化性心脑血管疾病的发病危险呈负相关，因此对ApoA?I的水平的检测可起到疾病预示的作用。目前，国内外ApoA?I测定试剂盒大多采用透射比浊法(Immunoturbidimetricassay，ITA)，该法具有快速、准确的特点，适用于大批量样本的测定。为了满足试剂盒开发和生产厂家对ApoA?I的要求，制备大批量高纯度的ApoA?I抗原显得尤为重要。[0004] 现有技术中，针对血清或血浆中载脂蛋白ApoA?I的纯化分离方法通常包括超高速离心、离子层析、凝胶电泳分离、超滤等，超高速离心对设备要求高，分离成本过高，离子层析存在特异性差，产物的纯度不足，通常离子层析还需要与其他方法进行结合，而且最终的分离纯度依然比较欠缺，凝胶电泳分离存在分离辨识度差，效率偏低，同时蛋白容易变性的缺陷，超滤分离目前无法进行精确分子量分离，分离产物中目标蛋白的纯度不足，且超滤分离对膜材要求较高，无法在批量化生产中进行稳定复现，因此超滤分离通常在目标分离物与其他混合物分子量差异较大时使用比较有效。[0005] 亲和层析分离是利用特定靶分子与目标分离物之间的特异性亲和作用，达到对目标分子的精确筛选和纯化的目的，而亲和层析最重要的过程在于对靶分子的筛选以及对应的缓冲和洗脱体系的搭配，通过合适的亲和层析体系更有希望可以达到对ApoA?I的高效分离，同时亲和层析体系具有重复使用的潜力。发明内容[0006] 有鉴于此，本发明提出了一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，旨在通过亲和层析的方式，提高从血清中对人载脂蛋白A?I分离纯化的效率。[0007] 本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，所述分离纯化方法具体包括如下步骤：[0008] S1、将冻融处理后的血清样本进行离心、过滤得到澄清样本；[0009] S2、将步骤S1得到的澄清样本依次进行除脂、亲和层析后得到不同纯度的蛋白洗脱液；[0010] S3、将步骤S2得到的不同纯度的蛋白洗脱液混合后进行后处理后得到人载脂蛋白A?I。[0011] 在一些实施方式中，所述步骤S1中，冻融处理具体包括如下步骤：将待处理的血清样本在?20至?80℃条件下冷冻得到冷冻样本，冷冻时间≥24h；将得到的冷冻样本置于2?8℃条件下解冻得到血清样本。[0012] 在一些实施方式中，所述步骤S1中，离心处理的参数如下：转速为7000?9000rpm，时间为15?25min。[0013] 在一些实施方式中，所述步骤S2中，除脂的具体步骤如下：在25?30℃条件下，在步骤S1得到的澄清样本中加入沉淀剂，搅拌均匀后进行离心处理，得到上清液。[0014] 在一些实施方式中，所述沉淀剂为质量浓度为1.5?2.5％的磷钨酸?镁溶液，离心处理的参数如下：转速为7000?9000rpm，时间为10?20min。[0015] 在一些实施方式中，所述步骤S2中，所述亲和层析采用配体亲和层析，所述配体亲和层析的具体步骤如下：将除脂后的样本进行透析和过滤后，加入到配体亲和层析柱中，在25?30℃下用缓冲液淋洗至基线，用洗脱液洗脱，得到不同纯度的蛋白洗脱液。[0016] 在一些实施方式中，所述缓冲液为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且所述Tris?HCl体系中含有0.1MNaCl，所述洗脱液为pH为6?7、质量浓度为0.1M的吐温20水溶液体系，且所述吐温20水溶液体系中的pH调节剂为柠檬酸。本发明采用上述缓冲液体系和吐温20水溶液体系，尤其是通过协调吐温20水溶液体系中的主要成分、浓度和柠檬酸，不仅能进一步提高洗脱效果，且能使纯化效率达到最高，使最终得到的人载脂蛋白A?I纯化的含量和浓度都保持在较高水平。[0017] 在一些实施方式中，所述配体亲和层析柱的制备方法具体包括如下步骤：[0018] AI、将罗非鱼Ig单克隆抗体在偶联缓冲液中进行透析；[0019] A2、将固相配体支持物加入到层析柱中，然后将经过步骤S1透析后的罗非鱼Ig单克隆抗体加入到层析柱中，静置12h；[0020] A3、用偶联缓冲液冲洗层析柱；[0021] A4、在冲洗后的层析柱中加入封闭缓冲液；[0022] A5、依次用碱性缓冲液、酸性缓冲液和偶联缓冲液清洗层析柱；[0023] A6、将层析柱用过柱缓冲液浸泡，得到亲和层析柱。[0024] 本发明将罗非鱼Ig单克隆抗体应用于配体亲和层析柱的制备，在后续的层析处理过程中，能用于人载脂蛋白A?I的特异性结合，起到纯化作用，便于后续分离得到人载脂蛋白A?I。[0025] 在一些实施方式中，所述步骤A1、A3和A5中，偶联缓冲液均为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且所述Tris?HCl体系中含有0.05MNaCl；[0026] 所述步骤A2中，固相配体支持物为琼脂多糖4B；[0027] 所述步骤A5中，碱性缓冲液包括如下组分：0.2M的NaHCO3和0.05M的NaCl，且所述碱性缓冲液的pH为8.3；[0028] 酸性缓冲液为pH为6.0、质量浓度为0.1M的柠檬酸体系，且所述柠檬酸体系中含有0.05MNaCl。[0029] 在一些实施方式中，所述步骤A3中，采用的偶联缓冲液的体积为层析柱的体积的至少5倍。[0030] 在一些实施方式中，步骤A5中，清洗层析柱采用的碱性缓冲液、酸性缓冲液和偶联缓冲液的体积均为层析柱的体积的至少5倍，且循环清洗至少3次。[0031] 在一些实施方式中，所述透析的透析体系如下：透析膜为孔径为10kDa的半透膜，透析液为质量浓度为0.05％、pH为6?7的吐温20水溶液。[0032] 在一些实施方式中，所述步骤S6中，后处理包括膜包分离、浓缩、透析、离心和过滤处理并检测合格后，得到满足要求的APOAI蛋白。[0033] 本发明的分离提纯方法相对于现有技术具有以下有益效果：[0034] 本发明对血清进行冻融和过滤处理，然后对上清液进行除脂，从而排除会对亲和层析产生干扰的物质，然后对除脂后的上清液体系进行亲和层析，并进行洗脱等后处理，从而获得了高浓度、高含量的人载脂蛋白A?I的产品，本发明通过该分离纯化步骤，最终得到的产物纯度高，同时含量也更高，纯化步骤易于进行更大规模的生产，且亲和层析用到的设备易于维护。附图说明[0035] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0036] 图1为本发明实施例1中步骤S2上清液和沉淀的电泳图；[0037] 图2为本发明实施例2中步骤S2中不同浓度洗脱液的电泳图。具体实施方式[0038] 下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。[0039] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明实施例所属技术领域普通技术人员通常理解相同的含义。如果此部分中陈述的定义与通过引用纳入本文的所述专利、专利申请、公布的专利申请和其他出版物中陈述的定义相反或其他方面不一致，此部分中列出的定义优先与通过引用纳入本文中的定义。[0040] 下述实施例中使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。所用材料、试剂和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。[0041] 当量、浓度或者其他值或参数以范围、优选范围或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、1至2”、1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。[0042] 以下实施例中，磷钨酸?镁沉淀剂的配制方法如下：[0043] 称取磷钨酸4g溶于50ml蒸馏水中，然后加入1mol/LNaOH16ml，混合均匀后，加蒸馏水定溶至100ml，调pH至7.6。然后取前述磷钨酸钠溶液40ml，加2mol/LMgCl210ml，加生理盐水至100ml，得到质量浓度为2.5％的磷钨酸?镁溶液，其他浓度在此浓度基础上采用生理盐水进行稀释得到。[0044] 实施例1[0045] 本实施例提供一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，具体包括如下步骤：[0046] S1、将待处理的血清样本在?20℃条件下冷冻得到冷冻样本，冷冻时间25h，将得到的冷冻样本置于2℃条件下解冻得到血清样本，然后血清样本在转速为7000rpm条件下进行离心15min、过滤得到澄清样本；[0047] S2、在25℃条件下，在步骤S1得到的澄清样本中加入质量浓度为1.5％的磷钨酸?镁溶液，搅拌均匀后在转速为7000rpm条件下进行离心处理10min，得到上清液，分别将上清液和沉淀进行电泳检测，得到如图1所示结果，其中泳道2?5分别为上清液稀释10倍、20倍、40倍和80倍，泳道7?10分别为沉淀物稀释10倍、20倍、40倍和80倍，然后将上清液进行配体亲和层析后得到不同纯度的蛋白洗脱液，其中，配体亲和层析的具体步骤如下：将除脂后的样本进行透析和过滤后，加入到配体亲和层析柱中，在25℃下用缓冲液淋洗至基线，用洗脱液洗脱，得到不同纯度的蛋白洗脱液，对蛋白洗脱液进行电泳检测，得到如图2所示结果，其中泳道1为Marker，泳道2?4为不同浓度洗脱液，其中，透析的透析体系如下：透析膜为孔径为10kDa的半透膜，透析液为质量浓度为0.05％、pH为6的吐温20水溶液。[0048] S3、将步骤S2得到的不同纯度的蛋白洗脱液混合后进行膜包分离、浓缩、透析、离心和过滤处理并检测合格后，得到满足要求的APOAI蛋白。[0049] 本实施例中，步骤S2中，缓冲液为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且Tris?HCl体系中含有0.1MNaCl，洗脱液为pH为6、质量浓度为0.1M的吐温20水溶液体系，且吐温20水溶液体系中的pH调节剂为柠檬酸。[0050] 本实施例中，配体亲和层析柱的制备方法具体包括如下步骤：[0051] AI、将罗非鱼Ig单克隆抗体在偶联缓冲液中进行透析；[0052] A2、将琼脂多糖4B加入到层析柱中，然后将经过步骤S1透析后的罗非鱼Ig单克隆抗体加入到层析柱中，静置12h；[0053] A3、用6倍层析柱体积偶联缓冲液冲洗层析柱；[0054] A4、在冲洗后的层析柱中加入封闭缓冲液；[0055] A5、依次用6倍层析柱体积碱性缓冲液、酸性缓冲液和偶联缓冲液清洗层析柱，循环3次；[0056] A6、将层析柱用过柱缓冲液浸泡，得到亲和层析柱。[0057] 具体地，步骤A1、A3和A5中，偶联缓冲液均为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且所述Tris?HCl体系中含有0.05MNaCl；[0058] 具体地，步骤A5中，碱性缓冲液包括如下组分：0.2M的NaHCO3和0.05M的NaCl，且碱性缓冲液的pH为8.3；[0059] 具体地，酸性缓冲液为pH为6.0、质量浓度为0.1M的柠檬酸体系，且柠檬酸体系中含有0.05MNaCl。[0060] 实施例2[0061] 本实施例提供一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，具体包括如下步骤：[0062] S1、将待处理的血清样本在?40℃条件下冷冻得到冷冻样本，冷冻时间28h，将得到的冷冻样本置于3℃条件下解冻得到血清样本，然后血清样本在转速为7500rpm条件下进行离心17min、过滤得到澄清样本；[0063] S2、在27℃条件下，在步骤S1得到的澄清样本中加入质量浓度为1.8％的磷钨酸?镁溶液，搅拌均匀后在转速为7500rpm条件下进行离心处理12min，得到上清液，然后将上清液进行配体亲和层析后得到不同纯度的蛋白洗脱液，其中，配体亲和层析的具体步骤如下：将除脂后的样本进行透析和过滤后，加入到配体亲和层析柱中，在27℃下用缓冲液淋洗至基线，用洗脱液洗脱，得到不同纯度的蛋白洗脱液，其中，透析的透析体系如下：透析膜为孔径为10kDa的半透膜，透析液为质量浓度为0.05％、pH为6.2的吐温20水溶液。[0064] S3、将步骤S2得到的不同纯度的蛋白洗脱液混合后进行膜包分离、浓缩、透析、离心和过滤处理并检测合格后，得到满足要求的APOAI蛋白。[0065] 本实施例中，步骤S2中，缓冲液为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且Tris?HCl体系中含有0.1MNaCl，洗脱液为pH为6.2、质量浓度为0.1M的吐温20水溶液体系，且吐温20水溶液体系中的pH调节剂为柠檬酸。[0066] 本实施例中，配体亲和层析柱的制备方法具体包括如下步骤：[0067] AI、将罗非鱼Ig单克隆抗体在偶联缓冲液中进行透析；[0068] A2、将琼脂多糖4B加入到层析柱中，然后将经过步骤S1透析后的罗非鱼Ig单克隆抗体加入到层析柱中，静置12h；[0069] A3、用7倍层析柱体积偶联缓冲液冲洗层析柱；[0070] A4、在冲洗后的层析柱中加入封闭缓冲液；[0071] A5、依次用7倍层析柱体积碱性缓冲液、酸性缓冲液和偶联缓冲液清洗层析柱，循环4次；[0072] A6、将层析柱用过柱缓冲液浸泡，得到亲和层析柱。[0073] 具体地，步骤A1、A3和A5中，偶联缓冲液均为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且所述Tris?HCl体系中含有0.05MNaCl；[0074] 具体地，步骤A5中，碱性缓冲液包括如下组分：0.2M的NaHCO3和0.05M的NaCl，且碱性缓冲液的pH为8.3；[0075] 具体地，酸性缓冲液为pH为6.0、质量浓度为0.1M的柠檬酸体系，且柠檬酸体系中含有0.05MNaCl。[0076] 实施例3[0077] 本实施例提供一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，具体包括如下步骤：[0078] S1、将待处理的血清样本在?50℃条件下冷冻得到冷冻样本，冷冻时间25h，将得到的冷冻样本置于4℃条件下解冻得到血清样本，然后血清样本在转速为8000rpm条件下进行离心20min、过滤得到澄清样本；[0079] S2、在30℃条件下，在步骤S1得到的澄清样本中加入质量浓度为2％的磷钨酸?镁溶液，搅拌均匀后在转速为8000rpm条件下进行离心处理15min，得到上清液，然后将上清液进行配体亲和层析后得到不同纯度的蛋白洗脱液，其中，配体亲和层析的具体步骤如下：将除脂后的样本进行透析和过滤后，加入到配体亲和层析柱中，在30℃下用缓冲液淋洗至基线，用洗脱液洗脱，得到不同纯度的蛋白洗脱液，其中，透析的透析体系如下：透析膜为孔径为10kDa的半透膜，透析液为质量浓度为0.05％、pH为6.5的吐温20水溶液。[0080] S3、将步骤S2得到的不同纯度的蛋白洗脱液混合后进行膜包分离、浓缩、透析、离心和过滤处理并检测合格后，得到满足要求的APOAI蛋白。[0081] 本实施例中，步骤S2中，缓冲液为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且Tris?HCl体系中含有0.05MNaCl，洗脱液为pH为6.5、质量浓度为0.1M的吐温20水溶液体系，且吐温20水溶液体系中的pH调节剂为柠檬酸。[0082] 本实施例中，配体亲和层析柱的制备方法具体包括如下步骤：[0083] AI、将罗非鱼Ig单克隆抗体在偶联缓冲液中进行透析；[0084] A2、将琼脂多糖4B加入到层析柱中，然后将经过步骤S1透析后的罗非鱼Ig单克隆抗体加入到层析柱中，静置12h；[0085] A3、用6倍层析柱体积偶联缓冲液冲洗层析柱；[0086] A4、在冲洗后的层析柱中加入封闭缓冲液；[0087] A5、依次用6倍层析柱体积碱性缓冲液、酸性缓冲液和偶联缓冲液清洗层析柱，循环6次；[0088] A6、将层析柱用过柱缓冲液浸泡，得到亲和层析柱。[0089] 具体地，步骤A1、A3和A5中，偶联缓冲液均为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且所述Tris?HCl体系中含有0.05MNaCl；[0090] 具体地，步骤A5中，碱性缓冲液包括如下组分：0.2M的NaHCO3和0.05M的NaCl，且碱性缓冲液的pH为8.3；[0091] 具体地，酸性缓冲液为pH为6.0、质量浓度为0.1M的柠檬酸体系，且柠檬酸体系中含有0.05MNaCl。[0092] 实施例4[0093] 本实施例提供一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，具体包括如下步骤：[0094] S1、将待处理的血清样本在?60℃条件下冷冻得到冷冻样本，冷冻时间24h，将得到的冷冻样本置于7℃条件下解冻得到血清样本，然后血清样本在转速为8500rpm条件下进行离心22min、过滤得到澄清样本；[0095] S2、在25℃条件下，在步骤S1得到的澄清样本中加入质量浓度为2.2％的磷钨酸?镁溶液，搅拌均匀后在转速为8500rpm条件下进行离心处理18min，得到上清液，然后将上清液进行配体亲和层析后得到不同纯度的蛋白洗脱液，其中，配体亲和层析的具体步骤如下：将除脂后的样本进行透析和过滤后，加入到配体亲和层析柱中，在25℃下用缓冲液淋洗至基线，用洗脱液洗脱，得到不同纯度的蛋白洗脱液，其中，透析的透析体系如下：透析膜为孔径为10kDa的半透膜，透析液为质量浓度为0.05％、pH为6.8的吐温20水溶液。[0096] S3、将步骤S2得到的不同纯度的蛋白洗脱液混合后进行膜包分离、浓缩、透析、离心和过滤处理并检测合格后，得到满足要求的APOAI蛋白。[0097] 本实施例中，步骤S2中，缓冲液为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且Tris?HCl体系中含有0.1MNaCl，洗脱液为pH为6.8、质量浓度为0.1M的吐温20水溶液体系，且吐温20水溶液体系中的pH调节剂为柠檬酸。[0098] 本实施例中，配体亲和层析柱的制备方法具体包括如下步骤：[0099] AI、将罗非鱼Ig单克隆抗体在偶联缓冲液中进行透析；[0100] A2、将琼脂多糖4B加入到层析柱中，然后将经过步骤S1透析后的罗非鱼Ig单克隆抗体加入到层析柱中，静置12h；[0101] A3、用7倍层析柱体积偶联缓冲液冲洗层析柱；[0102] A4、在冲洗后的层析柱中加入封闭缓冲液；[0103] A5、依次用7倍层析柱体积碱性缓冲液、酸性缓冲液和偶联缓冲液清洗层析柱，循环4次；[0104] A6、将层析柱用过柱缓冲液浸泡，得到亲和层析柱。[0105] 具体地，步骤A1、A3和A5中，偶联缓冲液均为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且所述Tris?HCl体系中含有0.05MNaCl；[0106] 具体地，步骤A5中，碱性缓冲液包括如下组分：0.2M的NaHCO3和0.05M的NaCl，且碱性缓冲液的pH为8.3；[0107] 具体地，酸性缓冲液为pH为6.0、质量浓度为0.1M的柠檬酸体系，且柠檬酸体系中含有0.05MNaCl。[0108] 实施例5[0109] 本实施例提供一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，具体包括如下步骤：[0110] S1、将待处理的血清样本在?80℃条件下冷冻得到冷冻样本，冷冻时间27h，将得到的冷冻样本置于2?8℃条件下解冻得到血清样本，然后血清样本在转速为7000?9000rpm条件下进行离心15?25min、过滤得到澄清样本；[0111] S2、在25℃条件下，在步骤S1得到的澄清样本中加入质量浓度为2.5％的磷钨酸?镁溶液，搅拌均匀后在转速为9000rpm条件下进行离心处理20min，得到上清液，然后将上清液进行配体亲和层析后得到不同纯度的蛋白洗脱液，其中，配体亲和层析的具体步骤如下：将除脂后的样本进行透析和过滤后，加入到配体亲和层析柱中，在25℃下用缓冲液淋洗至基线，用洗脱液洗脱，得到不同纯度的蛋白洗脱液，其中，透析的透析体系如下：透析膜为孔径为10kDa的半透膜，透析液为质量浓度为0.05％、pH为7的吐温20水溶液。[0112] S3、将步骤S2得到的不同纯度的蛋白洗脱液混合后进行膜包分离、浓缩、透析、离心和过滤处理并检测合格后，得到满足要求的APOAI蛋白。[0113] 本实施例中，步骤S2中，缓冲液为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且Tris?HCl体系中含有0.1MNaCl，洗脱液为pH为7、质量浓度为0.1M的吐温20水溶液体系，且吐温20水溶液体系中的pH调节剂为柠檬酸。[0114] 本实施例中，配体亲和层析柱的制备方法具体包括如下步骤：[0115] AI、将罗非鱼Ig单克隆抗体在偶联缓冲液中进行透析；[0116] A2、将琼脂多糖4B加入到层析柱中，然后将经过步骤S1透析后的罗非鱼Ig单克隆抗体加入到层析柱中，静置12h；[0117] A3、用5倍层析柱体积偶联缓冲液冲洗层析柱；[0118] A4、在冲洗后的层析柱中加入封闭缓冲液；[0119] A5、依次用5倍层析柱体积碱性缓冲液、酸性缓冲液和偶联缓冲液清洗层析柱，循环3次；[0120] A6、将层析柱用过柱缓冲液浸泡，得到亲和层析柱。[0121] 具体地，步骤A1、A3和A5中，偶联缓冲液均为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且所述Tris?HCl体系中含有0.05MNaCl；[0122] 具体地，步骤A5中，碱性缓冲液包括如下组分：0.2M的NaHCO3和0.05M的NaCl，且碱性缓冲液的pH为8.3；[0123] 具体地，酸性缓冲液为pH为6.0、质量浓度为0.1M的柠檬酸体系，且柠檬酸体系中含有0.05MNaCl。[0124] 对比例1[0125] 本对比例提供一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，与实施例3的区别仅在于，本对比例在步骤S2中采用的洗脱液为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且Tris?HCl体系中含有0.5MNaCl，其他与实施例3相同，此处不再赘述。[0126] 对比例2[0127] 本对比例提供一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，与实施例3的区别仅在于，本对比例在步骤S2中采用的洗脱液中，pH调节剂为醋酸，其他与实施例3相同，此处不再赘述。[0128] 对比例3[0129] 本对比例提供一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，与实施例3的区别仅在于，本对比例在步骤S2中采用的洗脱液中，将吐温20替换成曲拉通X100，其他与实施例3相同，此处不再赘述。[0130] 对比例4[0131] 本对比例提供一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，与实施例3的区别仅在于，本对比例在步骤S2中采用的洗脱液的pH为5.5，其他与实施例3相同，此处不再赘述。[0132] 对比例5[0133] 本对比例提供一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，与实施例3的区别仅在于，本对比例在步骤S2中采用的洗脱液的pH为7.5，其他与实施例3相同，此处不再赘述。[0134] 对比例6[0135] 本对比例提供一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，与实施例3的区别仅在于，本对比例步骤S2采用专利号为CN114716536A中的层析步骤，具体步骤如下：[0136] S1、将待处理的血清样本在?50℃条件下冷冻得到冷冻样本，冷冻时间25h，将得到的冷冻样本置于4℃条件下解冻得到血清样本，然后血清样本在转速为8000rpm条件下进行离心20min、过滤得到澄清样本；[0137] S2、在25℃条件下，在步骤S1得到的澄清样本中加入质量浓度为2％的磷钨酸?镁溶液，搅拌均匀后在转速为8000rpm条件下进行离心处理15min，得到上清液，然后将上清液进行疏水层析纯化和离子交换层析纯化后得到不同纯度的蛋白洗脱液，其中，透析的透析体系如下：透析膜为孔径为10kDa的半透膜，透析液为质量浓度为0.05％、pH为6.5的吐温20水溶液。[0138] S3、将步骤S2得到的第二洗脱液进行超滤分离、透析和浓缩后得到人载脂蛋白A?I。[0139] 本对比例中，步骤S2中，缓冲液为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且Tris?HCl体系中含有0.5MNaCl，洗脱液为pH为6.5、质量浓度为0.1M的吐温20水溶液体系，且吐温20水溶液体系中的pH调节剂为柠檬酸。[0140] 步骤S2的具体步骤如下：[0141] S201、选用GE生产的型号为PhenylSepharoseTMHighPerformance疏水层析填料，利用第一平衡缓冲液(50mMTris?HCl+10mMNaCl)平衡疏水柱，用第一洗脱缓冲液(50mMTris?HCl+50mMNaCl)洗脱杂蛋白，用第二洗脱缓冲液(20mMTris?HCl)洗脱目的蛋白ApoA?I，并分管收集对应的洗脱液。然后，利用聚丙烯酰胺(SDS?PAGE)凝胶电泳检测各管洗脱液蛋白纯度，将含量较多纯度较高的洗脱液合在一起，即将满足混合条件的所述洗脱液混合在一起，得到第一洗脱液；[0142] 将疏水层析纯化后的所述第一洗脱液进行离子交换层析纯化，得到对应的第二洗脱液：[0143] S202、离子交换层析纯化[0144] 选用GE生产的型号为DEAESepharoseF.F.离子交换层析填料，利用第二平衡缓冲液(50mMTris?HCl+50mMNaCl)平衡离子交换柱，用第三洗脱缓冲液(50mMTris?HCl+50mMNaCl)洗脱杂蛋白，用第四洗脱缓冲液(50mMTris?HCl+150mMNaCl)洗脱目的蛋白ApoA?I，分管收集洗脱液，得到对应的第二洗脱液。[0145] 对比例7[0146] 本对比例提供一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，与实施例3的区别仅在于，本对比例在亲和层析柱的制备过程中，将罗非鱼Ig单克隆抗体替换为小鼠抗人apoAI，其他与实施例3相同，此处不再赘述。[0147] 对比例8[0148] 本对比例提供一种人载脂蛋白A?I的分离纯化方法，具体包括如下步骤：[0149] S1、将待处理的血清样本在?50℃条件下冷冻得到冷冻样本，冷冻时间25h，将得到的冷冻样本置于4℃条件下解冻得到血清样本，然后血清样本在转速为8000rpm条件下进行离心20min、过滤得到澄清样本；[0150] S2、在25℃条件下，将步骤S1得到的澄清样本进行配体亲和层析后得到不同纯度的蛋白洗脱液，其中，配体亲和层析的具体步骤如下：将除脂后的样本进行透析和过滤后，加入到配体亲和层析柱中，在25℃下用缓冲液淋洗至基线，用洗脱液洗脱，得到不同纯度的蛋白洗脱液，其中，透析的透析体系如下：透析膜为孔径为10kDa的半透膜，透析液为质量浓度为0.05％、pH为6.5的吐温20水溶液。[0151] S3、将步骤S2得到的不同纯度的蛋白洗脱液混合后进行膜包分离、浓缩、透析、离心和过滤处理并检测合格后，得到满足要求的APOAI蛋白。[0152] 本对比例中，步骤S2中，缓冲液为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且Tris?HCl体系中含有0.05MNaCl，洗脱液为pH为6.5、质量浓度为0.1M的吐温20水溶液体系，且吐温20水溶液体系中的pH调节剂为柠檬酸。[0153] 本对比例中，配体亲和层析柱的制备方法具体包括如下步骤：[0154] AI、将罗非鱼Ig单克隆抗体在偶联缓冲液中进行透析；[0155] A2、将琼脂多糖4B加入到层析柱中，然后将经过步骤S1透析后的罗非鱼Ig单克隆抗体加入到层析柱中，静置12h；[0156] A3、用6倍层析柱体积偶联缓冲液冲洗层析柱；[0157] A4、在冲洗后的层析柱中加入封闭缓冲液；[0158] A5、依次用6倍层析柱体积碱性缓冲液、酸性缓冲液和偶联缓冲液清洗层析柱，循环6次；[0159] A6、将层析柱用过柱缓冲液浸泡，得到亲和层析柱。[0160] 具体地，步骤A1、A3和A5中，偶联缓冲液均为pH为8.0、质量浓度为0.1M的Tris?HCl体系，且Tris?HCl体系中含有0.05MNaCl；[0161] 具体地，步骤A5中，碱性缓冲液包括如下组分：0.2M的NaHCO3和0.05M的NaCl，且碱性缓冲液的pH为8.3；[0162] 具体地，酸性缓冲液为pH为6.0、质量浓度为0.1M的柠檬酸体系，且柠檬酸体系中含有0.05MNaCl。[0163] 发明人对实施例1?5及对比例1?8得到的载脂蛋白A?I进行性能表征，具体步骤如下：[0164] 载脂蛋白AI纯度分析：将实施例1?5及对比例1?8得到的人载脂蛋白A?I分别取10μL，用20mMTris?HClpH7.4稀释至1mg/mL，取样20μL，进行15％SDS?PAGE变性非还原胶(Mark)检测，考马斯亮蓝染色后使用molecularImager凝胶成像仪分析目的蛋白的纯度，从SDS?PAGE图谱可以总结出实施例1?5及对比例1?8制得的人载脂蛋白A?I的纯度分别如表1所示：[0165] 载脂蛋白AI收率计算：计算每升血清中所得人载脂蛋白A?I的重量。[0166] 载脂蛋白AI稳定性测定：取实施例1?5及对比例1?8纯化得到的人载脂蛋白A?I样品冻融1次、3次、5次、7次稳定性和37℃加速1天、3天、5天、7天热稳定性，采用北京安图的载脂蛋白AI(ApoAI)测定试剂盒(免疫比浊法)检测人载脂蛋白AI的活性浓度，样品均稀释4倍测定。检测结果如表1所示：[0167] 表1：实施例1?5及对比例1?8制得的人载脂蛋白A?I的检测分析结果表[0168][0169] 从上述结果可以看出，采用本发明的制备方法可以得到纯度大于98％的人载脂蛋白A?I，而且，本发明纯化所得人载脂蛋白A?I的收率高，且采用本发明制得的人载脂蛋白A?I的冻融稳定性和热稳定性较好，降幅均在10％以内。[0170] 从实施例1?实施例5的表征数据可以看出，当所采用磷钨酸?镁试剂的浓度从1.5％逐渐提升至2.5％的过程中，所得人载脂蛋白A?I的纯度先升高，后降低，考虑可能是因为经过除脂后，ApoAI的脂化物更少，对亲和层析影响更。虼，所得纯化产物的纯度更高，而稳定性测试数据表明，当磷钨酸?镁试剂的浓度在2.2％左右时，所得产物的稳定性最佳，可能是因为在该浓度下，对脂质杂质去除率最高，同时残余的磷钨酸?镁更少，对ApoAI的稳定性影响减。笔褂门ǘ绕褪，由于脂质体的影响，对ApoAI的稳定性产生了一定负面影响。[0171] 从实施例3与对比例1?5的数据可以看出，采用本发明的亲和层析洗脱体系，可以更好地对亲和吸附的ApoAI进行洗脱，且洗脱后的ApoAI稳定性高，当界面剂、pH调节剂、pH值等选择改变时，均会产生较大的影响，可以看出，在采用罗非鱼Ig单克隆抗体作为亲和层析的特异性亲和的靶分子后，需要与pH为6?7、质量浓度为0.1M的吐温20水溶液体系，且所述吐温20水溶液体系中的pH调节剂为柠檬酸的洗脱液进行洗脱，才能获得良好的洗脱效果。[0172] 对比例6与实施例3的数据对比可以看出，相比现有技术的人载脂蛋白A?I的纯化方法，本发明的纯化方法可以获得更高的纯度和收率，且纯化后的ApoAI稳定性更好。[0173] 对比例7采用同样可以对ApoAI进行特异结合的小鼠抗人apoAI抗体作为靶分子，其所能达到的纯化效果仍不及本发明的纯化效果，且小鼠抗人apoAI抗体价格昂贵。[0174] 对比例8在亲和层析前未经过磷钨酸?镁除脂沉淀处理，最终纯化所得ApoAI的纯度、收率以及稳定性均不及本发明的纯化方法得到的ApoAI，考虑可能是因为未经过除脂的血清中存在其他的脂质杂质同样与靶分子产生了特异性结合，从而影响了纯化产物的纯度，且纯化产物最终的稳定性也受到一定影响。[0175] 以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

专利地区：湖北

专利申请日期：2024-02-26

专利公开日期：2024-08-02

专利公告号：CN118047854B