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专利名称：一种高分辨质谱测定六堡茶中氨基酸类化合物的方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202211250966.1

专利申请（专利权）人：梧州市食品药品检验所
权利人地址：广西壮族自治区梧州市万秀区西环路中段198号

专利发明（设计）人：罗达龙,王华,覃蓝,许秀华,吴琳,黄蘅,孙良广

专利摘要：本发明公开了一种高分辨质谱测定六堡茶中氨基酸类化合物的方法，属于茶叶成分测定的技术领域，利用该测定方法能够准确测定出六堡茶样品中所含氨基酸化合物的种类，具有抗干扰性好、测定速度快、专属性强的特点；包括以下步骤：(1)分别取茶类氨基酸化合物对照品经溶解、稀释过滤后，取对照品过滤液放入串联液质联用仪中测定得到的图谱信息后建立对比数据库；(2)取六堡茶样品经提取、离心、过滤后，取过滤液放入串联液质联用仪中测定，将得到的测定图谱信息与步骤(1)的对比数据库进行匹配后得到测定结果。

主权利要求：
1.一种高分辨质谱测定六堡茶中氨基酸类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别取茶类氨基酸化合物对照品经溶解、稀释过滤后，取对照品过滤液放入串联液质联用仪中测定得到的图谱信息后建立对比数据库；
(2)取六堡茶样品经提取、离心、过滤后，取过滤液放入串联液质联用仪中测定，将得到的测定图谱信息与步骤(1)的对比数据库进行匹配后得到测定结果；
所选用的串联液质联用仪的型号为AgilentLC1290?6550?QTOF，所述的步骤(1)和步骤(2)的测定包括液相色谱测定和质谱测定：所述液相色谱测定条件为：
色谱柱：亲水作用色谱柱，规格为2.1mm×100mm，2.6μm；进样量：2μL；柱温：35℃；流速：
0.4mL/min；流动相A为0.1％甲酸水溶液，B为乙腈；采用梯度洗脱模式：0～5min：10％A～
35％A，90％B～65％B；5～5.01min：35％A～40％A，65％B～60％B；5.01～6.5min：40％A～
90％A，60％B～10％B；
所述质谱测定条件为：
干燥气温度：290℃；干燥气流速：12L/min；雾化器压力：45Psi；鞘气温度：400℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：3500V；喷嘴电压：1000V；裂解电压380V；扫描模式为自动二级采集模式，正模式，扫描范围1级50～500m/z，扫描范围2级50～500m/z，碰撞能量5～15V；
所述的步骤(1)中，所建立的对比数据库中包括各茶类氨基酸化合物名称、分子式、CAS号、精确质荷比和二级离子精确质荷比；
将六堡茶样品的测定图谱信息与步骤(1)的对比数据库进行匹配的具体步骤为：(1)从对比数据库中逐一抽取各茶类氨基酸化合物的精确质荷比，从六堡茶样品的测定图谱信息中获取其精确质荷比，两者进行匹配，若两个精确质荷比偏差小于5ppm，即进入下一步，认为不存在该化合物，进行下一茶类氨基酸化合物的匹配；
(2)从对比数据库中抽取该茶类氨基酸化合物的二级离子精确质荷比，从六堡茶样品的测定图谱信息中获取其二级离子精确质荷比，两者进行匹配，若两个二级离子精确质荷比偏差小于10ppm，即确定含有该茶类氨基酸化合物，否则认为不存在该化合物，返回步骤(1)进行下一茶类氨基酸化合物的匹配；
所述的步骤(1)中，所述的茶类氨基酸化合物对照品包括胱氨酸、色氨酸、络氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、赖氨酸、门冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、茶氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种高分辨质谱测定六堡茶中氨基酸类化合物的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，称取茶类氨基酸化合物对照品使用浓度为30％的乙腈水作为溶剂对其进行溶解并稀释，待用。
3.根据权利要求1所述的一种高分辨质谱测定六堡茶中氨基酸类化合物的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，取六堡茶样品加入浓度为30％的乙腈水中，所加入的六堡茶样品的质量与乙腈水的体积比为1：20，超声提取20min，放至室温后在4℃下离心10min，离心速度为9000r/min。
4.根据权利要求1所述的一种高分辨质谱测定六堡茶中氨基酸类化合物的方法，其特征在于，所述的步骤(1)和步骤(2)中，使用0.2μm有机膜将溶液过滤。 说明书 : 一种高分辨质谱测定六堡茶中氨基酸类化合物的方法技术领域[0001] 本发明涉及茶叶成分测定的技术领域，更具体地说，尤其涉及一种高分辨质谱测定六堡茶中氨基酸类化合物的方法。背景技术[0002] 六堡茶属黑茶类，选用苍梧县群体种、广西大中叶种及其分离、选育的品种、品系茶树的鲜叶为原料，按特定的工艺进行加工，具有独特品质特征的黑茶。[0003] 六堡茶的制作是采用当地的大叶种茶树的鲜叶作为原料，采摘标准是成熟新梢的芽叶，经杀青、揉捻、渥堆、复揉、干燥5道工序制成。杀青特点是低温杀青；揉捻则是以整形为主，细胞破碎为辅；渥堆是通过渥堆湿热作用，促进内含物质的变化，减掉苦涩味，使滋味变醇，消除青臭气，并使叶色变为深黄褐青。渥堆时期，掌握到出现黏汁，发出特有的醇香，即为适度，属于后发酵茶。用六堡散茶蒸制、压模，可制成六堡饼茶、六堡砖茶、六堡沱茶等。[0004] 成品茶中的氨基酸与茶叶年份、加工程度等有密切关系，是影响茶营养及保健功能及风味品质的关键化学成分之一，茶氨酸作为茶叶特有的化学成分，不仅是构成茶汤鲜爽，其还能降低茶的苦涩味，茶氨酸在提神、镇静、降压、抗癌和减肥等方面都具有较好的功效。茶叶中的氨基酸的含量和组成茶汤的滋味、色泽有较明显的影响，对茶汤的香气、鲜爽度起着决定作用。由于茶的年份和后发酵工艺不同，茶叶中的氨基酸与茶氨酸在茶叶中的含量差别较大，进而使六堡茶茶汤的口感和风味也有差别。[0005] 六堡茶汤中可能含有胱氨酸、色氨酸、络氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、赖氨酸、门冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、茶氨酸等这些氨基酸类化合物。现有的测定方法很难快速有效的测定出茶汤中具体含有哪些氨基酸类化合物。因此，亟待发明一种能有效的测定出六堡茶中所含氨基酸类化合物种类的方法，以便更好的评估六堡茶的品质。发明内容[0006] 本发明的目的在于提供一种高分辨质谱测定六堡茶中氨基酸类化合物的方法，利用该测定方法能够准确测定出六堡茶样品中所含氨基酸化合物的种类，具有抗干扰性好、测定速度快、专属性强的特点。[0007] 本发明的技术方案如下：[0008] 一种高分辨质谱测定六堡茶中氨基酸类化合物的方法，包括以下步骤：[0009] (1)分别取茶类氨基酸化合物对照品经溶解、稀释过滤后，取对照品过滤液放入串联液质联用仪中测定得到的图谱信息后建立对比数据库；[0010] (2)取六堡茶样品经提取、离心、过滤后，取过滤液放入串联液质联用仪中测定，将得到的测定图谱信息与步骤(1)的对比数据库进行匹配后得到测定结果。[0011] 进一步的，所述的步骤(1)中，所述的茶类氨基酸化合物对照品包括胱氨酸、色氨酸、络氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、赖氨酸、门冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、茶氨酸。[0012] 进一步的，所述的步骤(1)中，称取茶类氨基酸化合物对照品使用浓度为30％的乙腈水作为溶剂对其进行溶解并稀释，待用。[0013] 进一步的，所述的步骤(2)中，取六堡茶样品加入浓度为30％的乙腈水中，所加入的六堡茶样品的质量与乙腈水的体积比为1：20，超声提取20min，放至室温后在4℃下离心10min，离心速度为9000r/min。[0014] 进一步的，所述的步骤(1)和步骤(2)中，使用0.2μm有机膜将溶液过滤。[0015] 进一步的，所述的步骤(1)和步骤(2)的测定包括液相色谱测定和质谱测定：[0016] 所述液相色谱测定条件为：[0017] 色谱柱：亲水作用色谱柱，规格为2.1mm×100mm，2.6um；进样量：2μL；柱温：35℃；流速：0.4mL/min；流动相A为0.1％甲酸水溶液，B为乙腈；采用梯度洗脱模式：0～5min：10％A～35％A，90％B～65％B；5～5.01min：35％A～40％A，65％B～60％B；5.01～6.5min：40％A～90％A，60％B～10％B；[0018] 所述质谱测定条件为：[0019] 干燥气温度：290℃；干燥气流速：12L/min；雾化器压力：45Psi；鞘气温度：400℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：3500V；喷嘴电压：1000V；裂解电压380V；扫描模式为自动二级采集模式，正模式，扫描范围1级50～500m/z，扫描范围2级50～500m/z，碰撞能量5～15V。[0020] 进一步的，所述的步骤(1)中，所建立的对比数据库中包括各茶类氨基酸化合物名称、分子式、CAS号、精确质荷比和二级离子精确质荷比。[0021] 进一步的，将六堡茶样品的测定图谱信息与步骤(1)的对比数据库进行匹配的具体步骤为：[0022] (1)从对比数据库中逐一抽取各茶类氨基酸化合物的精确质荷比，从六堡茶样品的测定图谱信息中获取其精确质荷比，两者进行匹配，若两个精确质荷比偏差小于5ppm，即进入下一步，认为不存在该化合物，进行下一茶类氨基酸化合物的匹配；[0023] (2)从对比数据库中抽取该茶类氨基酸化合物的二级离子精确质荷比，从六堡茶样品的测定图谱信息中获取其二级离子精确质荷比，两者进行匹配，若两个二级离子精确质荷比偏差小于10ppm，即确定含有该茶类氨基酸化合物，否则认为不存在该化合物，返回步骤(1)进行下一茶类氨基酸化合物的匹配。[0024] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：[0025] 本发明的一种高分辨质谱测定六堡茶中氨基酸类化合物的方法，分别取茶类氨基酸化合物对照品经溶解、稀释过滤后，取对照品过滤液放入串联液质联用仪中测定得到的图谱信息后建立对比数据库；取六堡茶样品经提取、离心、过滤后，取过滤液放入串联液质联用仪中测定，将得到的测定图谱信息与对比数据库进行匹配后得到测定结果。该方法通过使用茶类氨基酸化合物的标准物质作为对照品进行定性测定，有效解决了茶叶中难以从复杂基质中分离目标峰与杂质峰的问题，测定中也不容易受到与其共流出的物质干扰，对复杂基质中的目标物定性的抗干扰性更好，也减少了从共流出物中分离目标物的时间，能够更快速准确的测定出结果，该方法的专属性强。具体实施方式[0026] 下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。[0027] 本发明的一种高分辨质谱测定六堡茶中氨基酸类化合物的方法，包括以下步骤：[0028] (1)分别取茶类氨基酸化合物对照品经溶解、稀释过滤后，取对照品过滤液放入串联液质联用仪中测定得到的图谱信息后建立对比数据库。[0029] 过程为称取茶类氨基酸化合物对照品使用浓度为30％的乙腈水作为溶剂对其进行溶解并稀释，待用。[0030] 进一步的，对稀释液使用0.2μm有机膜将溶液过滤，再放入串联液质联用仪中测定。所选用的串联液质联用仪的型号为AgilentLC1290?6550?QTOF。[0031] 使用在茶叶中可能存在的氨基酸化合物建立数据库。所述的茶类氨基酸化合物对照品包括胱氨酸、色氨酸、络氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、赖氨酸、门冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、茶氨酸。所建立的对比数据库中包括各茶类氨基酸化合物名称、分子式、CAS号、精确质荷比和二级离子精确质荷比，具体信息如表1所示。这些茶类氨基酸化合物对照品经过测定的结果与数据库进行匹配。[0032] 表1对比数据库具体信息表[0033][0034][0035] (2)取六堡茶样品经提取、离心、过滤后，取过滤液放入串联液质联用仪中测定，将得到的测定图谱信息与步骤(1)的对比数据库进行匹配后得到测定结果。[0036] 其中，取六堡茶样品加入浓度为30％的乙腈水中，所加入的六堡茶样品的质量与乙腈水的体积比为1：20，超声提取20min，放至室温后在4℃下离心10min，离心速度为9000r/min。[0037] 进一步的，使用0.2μm有机膜将溶液过滤。[0038] 进一步的，所述的步骤(1)和步骤(2)的测定包括液相色谱测定和质谱测定：[0039] 所述液相色谱测定条件为：[0040] 色谱柱：亲水作用色谱柱，规格为2.1mm×100mm，2.6um，或者性能相当的色谱柱；进样量：2μL；柱温：35℃；流速：0.4mL/min；流动相A为0.1％甲酸水溶液，B为乙腈；采用梯度洗脱模式：0～5min：10％A～35％A，90％B～65％B；5～5.01min：35％A～40％A，65％B～60％B；5.01～6.5min：40％A～90％A，60％B～10％B；流动相梯度如表2所示。[0041] 表2流动相梯度表[0042]时间/min 0.1％甲酸水溶液/％ 乙腈/％ 流速/(mL/min)0.00 10 90 0.405.00 35 65 0.405.01 40 60 0.406.50 90 10 0.40[0043] 所述质谱测定条件为：[0044] 干燥气温度：290℃；干燥气流速：12L/min；雾化器压力：45Psi；鞘气温度：400℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：3500V；喷嘴电压：1000V；裂解电压380V；扫描模式为自动二级采集模式(AutoMS/MS)，正模式，扫描范围1级50～500m/z，扫描范围2级50～500m/z，碰撞能量5～15V。[0045] 将六堡茶样品的测定图谱信息与步骤(1)的对比数据库进行匹配的具体步骤为：[0046] (1)从对比数据库中逐一抽取各茶类氨基酸化合物的精确质荷比，从六堡茶样品的测定图谱信息中获取其精确质荷比，两者进行匹配，若两个精确质荷比偏差小于5ppm，即进入下一步，认为不存在该化合物，进行下一茶类氨基酸化合物的匹配；[0047] (2)从对比数据库中抽取该茶类氨基酸化合物的二级离子精确质荷比，从六堡茶样品的测定图谱信息中获取其二级离子精确质荷比，两者进行匹配，若两个二级离子精确质荷比偏差小于10ppm，即鉴别点数达到大于等于4(根据欧盟非强制执行法案2002?657?EC中的表5进行计算)，确定含有该茶类氨基酸化合物，否则认为不存在该化合物，返回步骤(1)进行下一茶类氨基酸化合物的匹配。鉴别点数计算方式为母离子得到鉴别点数为2，通过母离子转换得到的每个产物离子(子离子)的鉴别点数为2.5，根据定性要求在高分辨质谱至少包含一个母离子与一个由母离子转换的产物离子(子离子)。定量方法为分别使用各茶类氨基酸化合物对照品对识别出的每个氨基酸物质用外标法定量，定量离子为一级母离子，定性离子为化合物对应的子离子，使用母离子与子离子计算丰度比，进而作为化合物的进一步定性。[0048] 氨基酸在液相测定的方法需要对氨基酸进行衍生才能在液相色谱仪进行测定，而使用质谱进行氨基酸测定则不需要进行衍生化前处理，通过溶剂提取待测样品后，可以用液相质谱直接测定样品中的氨基酸。在液相对氨基酸的进行定性时需要使用标准物质对色谱峰保留时间进行定性，在茶叶复杂基质中分离目标峰与杂质峰难度较大。测定中容易受到与其共流出的物质干扰，在对这些共流出物与目标物分离会耗费较长的时间，由于被测样品基质有一定区别使用液相法时需先对被测样品进行一定预实验后，确定梯度方法才能正式开展检测。高分辨质谱是监测被测物质的质荷比，在不对样品中的目标物与杂质峰进行分离的情况下也能通过质荷比进行定性，本发明的测定方法中使用的测定模式为自动二级检测模式，仪器可对监测范围内的质荷比在达到一定响应后自动帮其进行二级质谱监测，使收集的数据能同时获得一级质谱与二级质谱结果，通过二级质谱所得数据结合所建立的数据库，根据质谱定性四分原则对被测成分进行定性，对复杂基质中的目标物定性能达到很好的准确度，对复杂基质中的目标物定性的抗干扰性好，也减少了从共流出物中分离目标物的时间，能够更快速准确的测定出结果，该方法的专属性强。该测定方法对传统六堡茶和非传统六堡茶中氨基酸类化合物均有效。[0049] 实验例[0050] 在市场中购入标号为1～5号这5种六堡茶叶，分别测定出这些所含的氨基酸类化合物。其中，标号1的六堡茶叶为梧州市吉祥韵茶叶有限公司在2018年生产的型号为陈香3号的茶叶，标号2的六堡茶叶广西梧州纯好茶业有限公司在2012年生产的型号为古法三号的茶叶，标号3的六堡茶叶为广西梧州纯好茶业有限公司在2018年生产的型号为特制金花?2号的茶叶，标号4的六堡茶叶为梧州市古树六堡茶厂在2010年生产的型号为10112#的茶叶，标号5的六堡茶叶为梧州市古树六堡茶厂在2012年生产的型号为12308#的茶叶。[0051] 各取1～5号的六堡茶叶5g，分别各倒入一个250mL的锥形瓶中，往每个瓶中加入浓度为30％的乙腈水，各超声提取20min，放至室温。取样液在4℃冷冻离心10min，离心速度为9000r/min。完成离心后的离心液使用0.2μm有机膜过滤后再放入型号为AgilentLC1290?6550?QTOF的串联液质联用仪中测定。测定包括液相色谱测定和质谱测定：[0052] 所述液相色谱测定条件为：[0053] 色谱柱：亲水作用色谱柱，规格为2.1mm×100mm，2.6um，或者性能相当的色谱柱；进样量：2μL；柱温：35℃；流速：0.4mL/min；流动相A为0.1％甲酸水溶液，B为乙腈；采用梯度洗脱模式：0～5min：10％A～35％A，90％B～65％B；5～5.01min：35％A～40％A，65％B～60％B；5.01～6.5min：40％A～90％A，60％B～10％B。[0054] 所述质谱测定条件为：[0055] 干燥气温度：290℃；干燥气流速：12L/min；雾化器压力：45Psi；鞘气温度：400℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：3500V；喷嘴电压：1000V；裂解电压380V；扫描模式为自动二级采集模式(AutoMS/MS)，正模式，扫描范围1级50～500m/z，扫描范围2级50～500m/z，碰撞能量5、10、15V。[0056] 将1～5号的六堡茶叶得到的测定图谱信息与对比数据库进行匹配后得到的测定结果如表3?1和3?2所示。[0057] 表3?11～5号六堡茶叶测定结果[0058][0059] 表3?21～5号六堡茶叶测定结果[0060][0061][0062] 从上述测定结果可得，本发明的测定方法通过高分辨率质谱对复杂基质中目标成分的测定抗干扰性好，能够有效的测定出六堡茶叶中所含有的氨基酸类化合物，测定速度快且准确率高，其专属性也强。[0063] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

专利地区：广西

专利申请日期：2022-10-12

专利公开日期：2024-08-02

专利公告号：CN115480017B