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专利名称：一种利用极性化合物的溶解能的反相色谱定性鉴别方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310035819.0

专利申请（专利权）人：佳木斯大学
权利人地址：黑龙江省佳木斯市向阳区学府街258号

专利发明（设计）人：孙长海,肖梦馨,孙适远,张欣然

专利摘要：本发明公开了一种利用极性化合物的溶解能的反相色谱定性鉴别方法，包括：利用亚硝酸钠溶液，测定不同色谱条件下的死时间t0；将5种具有类似化学结构的化合物标准品溶液，进行反相高效液相色谱分析，测定不同色谱条件下的保留时间tR；计算上述5种化合物在不同色谱条件下的容量因子k′和容量因子的对数lnk′；计算上述5种化合物的隐形溶剂模下混合溶剂溶解自由能Es、气态下的水合能Ew、溶解自由能Et＝Es+Ew、构建色谱定性数学模型并验证；以色谱定性数学模型对同类极性化合物定性。

主权利要求：
1.一种利用极性化合物的溶解能的反相色谱定性鉴别方法，其特征在于，具体步骤如下：S1，利用亚硝酸钠溶液，测定不同色谱条件下的死时间t0；
S2，将5种具有类似化学结构的化合物标准品溶液，进行反相高效液相色谱分析，测定不同色谱条件下的保留时间tR；
S3，计算上述5种化合物在不同色谱条件下的容量因子k′；
S4，计算上述5种化合物在不同色谱条件下的容量因子的对数lnk′；
S5，利用量子化学计算软件计算上述5种化合物的隐形溶剂模下混合溶剂溶解自由能Es；
S6，利用量子化学计算软件计算上述5种化合物气态下的水合能Ew；
S7，计算上述5种化合物的溶解自由能Et=Es+Ew；
S8，构建上述5种化合物的色谱定性数学模型lnk′=b·Et；
S9，色谱定性数学模型的验证；
S10，以色谱定性数学模型对同类极性化合物定性；
其中，步骤S3和步骤S4中，按照公式k′=（tR?t0）/t0，计算不同色谱条件下5种化合物的容量因子k′及其对数lnk′；
步骤S5、步骤S6和步骤S7中，利用量子化学计算软件，对5种化合物进行结构优化，以能量最低的优化后结构为基。扑愀骰衔镌谝性溶剂模式下的溶解自由能Es、在气态模式下的水合能Ew和溶解自由能Et；
步骤S8中，以色谱保留值lnk′为因变量，溶解自由能Et为自变量进行一元线性回归，构建该类化合物的反相色谱定性鉴别数学模型lnk′=b·Et。
2.根据权利要求1所述的一种利用极性化合物的溶解能的反相色谱定性鉴别方法，其特征在于，步骤S1和步骤S2中，所述不同色谱条件下配比的流动相为甲醇：水＝90:10、80:
20、70:30、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、30:70、20:80和10:90；或乙腈：水＝90:10、
80:20、70:30、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、30:70、20:80和10:90。
3.根据权利要求1所述的一种利用极性化合物的溶解能的反相色谱定性鉴别方法，其特征在于，步骤S1和步骤S2中，固定相为C18柱，填料为十八烷基硅烷键合硅胶，包括但不限于粒径为1.7μm?5μm，柱长为100?250mm，柱径为3?4.6mm的反相色谱柱。
4.根据权利要求1所述的一种利用极性化合物的溶解能的反相色谱定性鉴别方法，其特征在于，步骤S2中，所述标准品的浓度为1?10μg/ml的水、醇、乙腈或者混合溶液。
5.根据权利要求1所述的一种利用极性化合物的溶解能的反相色谱定性鉴别方法，其特征在于，步骤S9中，另取3?5种同类型化合物标准品，重复步骤S1?S7，将得到的溶解自由能Et值代入到建立的数学模型lnk′=b·Et，得到理论色谱保留值lnk′（T）值；并与步骤S4得到的lnk′（E）实验值进行比较，计算相对误差是否小于10%，验证模型的可行性。
6.根据权利要求1所述的一种利用极性化合物的溶解能的反相色谱定性鉴别方法，其特征在于，步骤S10中，另取同类极性化合物样品，计算理论色谱保留值lnk′（T）值，实现该类化合物基于反相高效液相色谱?质谱联用技术的辅助鉴别目的。 说明书 : 一种利用极性化合物的溶解能的反相色谱定性鉴别方法技术领域[0001] 本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种利用极性化合物的溶解能的反相色谱定性鉴别方法。背景技术[0002] 现有的极性化合物的色谱定性方法主要包括：相对保留时间法，保留时间结合紫外可见光谱法，保留时间结合质谱裂解规律法，保留时间结合质谱数据库法以及保留时间结合标准品法。其中，保留时间结合标准品法未知化合物鉴别的金标准，但是，该方法要求先初步确定未知化合物的可能结构，然后再购买或制备标准品进行鉴定。该方法存在初步判断不准确，标准品昂贵或不易获取等缺点。高分辨质谱作为色谱的检测器，对未知化合物进行快速鉴别时，主要面临的问题有，一是数据库收载的化合物不全，纵使收载也存在匹配率高低不同的问题，再有就是，同一质荷比的提取色谱图，存在多个色谱峰的问题，也就是相同元素组成的同分异构体的问题，而且，在使用数据库匹配时，多个色谱峰经常被匹配为同一化合物。[0003] KaliszanR.关于具有复杂环状结构的醇和甲酯的保留指数与连接性指数的相关性的研究论文，开创了利用待分析化合物分子结构描述符与色谱保留行为之间的定量关系研究方向，也就是，现在被称为色谱定量结构保留关系(QSRR)方法。随着量子计算化学、色谱技术和统计学的发展，QSRR方法已广泛应用于预测化合物的保留时间、鉴别未知化合物、研究给定条件下色谱分离机制、定量比较各种色谱柱的分离性能、评估分析物的亲脂性和离解常数、评价药物的生物活性以及化学材料的特性等多个科学领域。[0004] 但在构建分析物保留值参数与分子描述之间数学模型时，也存在使用的分子描述符数量多，或需要使用到半经验分子描述符，以及未充分考滤保留参数测定的可重现性问题，使得该方法距离实际应用仍有较大的差距。[0005] 因此，如何利用色谱技术提供的待分析极性化合物物的色谱保留值、质谱提供的初步判断结果，通过量子化学计算得到的尽可能少的有物理意义的变量，构建色谱保留值与该变量之间的数学模型，鉴别同类极性化合物甚至其非光学同分异构体，以快速鉴定未知的极性化合物仍然是本领域技术人员亟需解决的关键科学问题。[0006] 本发明利用反相色谱分离极性化合物的原理是待分离的化合物在流动相与固定相之间分配能力的差异，导致不同的化合物在色谱中获得分离，其前提条件就是待分析的化合物在该色谱条件下的容量因子k′(或其对数lnk′)之间有差异。而化合物的容量因子主要与该化合物在流动相中的溶解能力相关，而化合物的溶解能可以利用量子化学计算软件计算或得，一种为隐性溶解模式，该模式计算简便，快速，对计算条件要求简单，一般计算机就可实现，但该模式未能体现溶剂与分子之间的水合能，因此，还需要再计算化合物的水合能，将二者加和为溶解能。另一种模式，为显示溶解模式，该模式得到的是综合溶解能，但该模式需要计算量教大，对计算条件要求苛刻，难以实现推广和应用。因此，本发明利用第一种方法计算化合物的溶解能Et为自变量，与化合物的容量因子的对数lnk′为因变量，构建色谱鉴别极性化合物的数学模型，是本领域技术人员亟需解决的问题。发明内容[0007] 有鉴于此，本发明提供了一种利用极性化合物的溶解能的反相色谱定性鉴别方法。[0008] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：[0009] 一种利用极性化合物的溶解能的反相色谱定性鉴别方法，具体步骤如下：[0010] S1，利用亚硝酸钠溶液，测定不同色谱条件下的死时间t0；[0011] S2，将5种具有类似化学结构的化合物标准品溶液，进行反相高效液相色谱分析，测定不同色谱条件下的保留时间tR；[0012] S3，计算上述5种化合物在不同色谱条件下的容量因子k′；[0013] S4，计算上述5种化合物在不同色谱条件下的容量因子的对数lnk′；[0014] S5，利用量子化学计算软件计算上述5种化合物的隐形溶剂模下混合溶剂溶解自由能Es；[0015] S6，利用量子化学计算软件计算上述5种化合物气态下的水合能Ew；[0016] S7，计算上述5种化合物的溶解自由能Et＝Es+Ew；[0017] S8，构建上述5种化合物的色谱定性数学模型lnk′＝b·Et；[0018] S9，色谱定性数学模型的验证；[0019] S10，以色谱定性数学模型对同类极性化合物定性。[0020] 优选的，步骤S1和步骤S2中，所述不同色谱条件下配比的流动相为甲醇：水＝90:10、80:20、70:30、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、30:70、20:80和10:90；或乙腈：水＝90:10、80:20、70:30、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、30:70、20:80和10:90。[0021] 优选的，步骤S1和步骤S2中，固定相为C18柱，填料为十八烷基硅烷键合硅胶，包括但不限于粒径为1.7μm?5μm，柱长为100?250mm，柱径为3?4.6mm的反相色谱柱。[0022] 优选的，步骤S2中，所述标准品的浓度为1?10μg/ml的水、醇、乙腈或者混合溶液。[0023] 优选的，步骤S3和步骤S4中，按照公式k′＝(tR?t0)/t0，计算不同色谱条件下5种化合物的容量因子k′及其对数lnk′。[0024] 优选的，步骤S5、步骤S6和步骤S7中，利用量子化学计算软件，对5种化合物进行结构优化，以能量最低的优化后结构为基。扑愀骰衔镌谝性溶剂模式下的溶解自由能Es、在气态模式下的水合能Ew和溶解自由能Et。[0025] 优选的，步骤S8中，以色谱保留值lnk′为因变量，溶解自由能Et为自变量进行一元线性回归，构建该类化合物的反相色谱定性鉴别数学模型lnk′＝b·Et。[0026] 优选的，步骤S9中，另取3?5种同类型化合物标准品，重复步骤S1?S7，将得到的溶解自由能Et值代入到建立的数学模型lnk′＝b·Et，得到理论色谱保留值lnk′(T)值；并与步骤S4得到的lnk′(E)实验值进行比较，计算相对误差是否小于10％，验证模型的可行性。[0027] 优选的，步骤S10中，另取同类极性化合物样品，计算理论色谱保留值lnk′(T)值，实现该类化合物基于反相高效液相色谱?质谱联用技术的辅助鉴别目的。[0028] 经由上述技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：[0029] 本发明仅用一种分子描述符(待分析物在流动相中的综合溶解能)及5种同类化合物的标准品构建数学模型，即可实现该类化合物的辅助定性分析，方法简便，准确率高，尤其适用于通过液质联用技术，确定其为某一类化合物，但难以确定其为具体为某一种化合物时的辅助定性鉴别分析。具体实施方式[0030] 下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0031] 实施例1：四种非同分异构体黄酮类化合物的鉴别[0032] 1、NaNO3溶液的制备[0033] 精密量取NaNO3固体10mg，置于10mL量瓶中，加纯净水至刻度，摇匀，得浓度为1％的NaNO3储备液备用。取100μLNaNO3储备液，置于10mL量瓶中，加纯净水至刻度，摇匀，过0.22μm水相微孔滤膜过滤后进样分析。[0034] 2、黄酮对照品溶液的制备[0035] 称取对照品5?羟基黄酮，白杨素，高良姜素，山奈酚，槲皮素各适量，分别置于100mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制备成5种黄酮储备液。精密移取适量，配制浓度为5μ?1g·mL 黄酮单对照品溶液，过0.22μm有机相微孔滤膜过滤后进样分析。[0036] 3、四种黄酮类化合物混合溶液的制备[0037] 称取杨梅素、金合欢素、金对草黄素、异鼠李素四种黄酮类化合物对照品各适量，置于100mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制备成4种黄酮混合物样品液。过0.22μm有机相微孔滤膜过滤后进样分析。[0038] 4、色谱条件[0039] 使用HypersilGOLDC18色谱柱(100mm×2.1mm，1.9μm)；流动相为0.1％甲酸水：甲醇?1(55:45)；柱温30℃；体积流量0.3mL·min ；进样量为5μL。[0040] 5、质谱条件[0041] 采用电喷雾离子源(ESI)；检测模式为FullMS?ddMS2正离子模式、负离子模式同时检测；检测范围100～1500m/z；离子电荷数1；离子化温度350℃；离子传输管温度320℃；喷雾电压3.5kV(+)/3.2kV(－)；鞘气压力35bar；辅助气(N2)压力10bar；碎裂电压20，40，60eV。[0042] 6、黄酮类化合物Ln(k')的测定[0043] 通过测定NaNO3在上述色谱条件下的保留行为，获得死时间t0。同时测得9种黄酮类化合物在该洗脱条件下的保留时间tR和调整保留时间tR′(tR′＝tR?t0)，根据公式k′＝tR′/t0，计算获得5种黄酮类化合物的定量参数容量因子k′的对数lnk′值，结果如表1所示。[0044] 7、黄酮类化合物溶解自由能Et的计算[0045] 7.1黄酮类化合物的结构优化[0046] 各黄酮化合物分子的初始几何结构由软件GaussView5.0给出，采用Molclus程序包对黄酮类化合物的进行构象搜索，生成分子初始构象，调用MOPAC2016在PM7级别下对各个结构进行初步优化。采用Gaussian09程序包中的密度泛函理论(DFT?B3lyp6?31G*)计算方法，对初步优化好的结构作为初始结构再次进行结构优化。[0047] 7.2黄酮类化合物隐性模式溶解自由能Es计算[0048] 采用量子化学软件中的密度泛函理论(DFT?B3lyp6?31G*)计算方法，计算黄酮化合物的单点能E0。采用(m062x?6?31G*)计算方法，对已优化的结果进行隐性溶剂模型能量计算，获得溶质溶于甲醇水(45:55)溶液的单点能ES0、计算5种黄酮类化合物甲醇水溶液溶解自由能ES(ES＝ES0?E0),结果如表1所示。[0049] 7.3黄酮类化合物的水合能EW计算[0050] 采用量子化学软件中的密度泛函理论(DFT?B3lyp6?31G*)计算方法，计算黄酮化合物的单点能EF0和水的单点能EW0。以及在黄酮的不同部位计算与一个水分子结合时的单点能EWF。计算5种黄酮类化合物甲醇水溶液溶解自由能EW(按公式1计算)，结果如表1所示。[0051][0052] 7.4黄酮类化合物的溶解自由能Et计算[0053] 计算5种黄酮类化合物在甲醇水溶液中的溶解自由能Et(Et＝EW+ES)，结果如表1所示。[0054] 表1黄酮类化合物反相色谱鉴别模型及四种黄酮类化合物鉴定结果[0055][0056] 注：*D＝(lnk′(T)?lnk′(E)/lnk′(E))×100[0057] 8、黄酮类化合物反相色谱定性鉴别模型的建立[0058] 将表1中五种模式黄酮类化合物的ln(k')值为因变量，Et值为自变量，进行一无线性回归，得回归方程如表1所示，结果表明二者之间线性关系良好。[0059] 9、黄酮类化合物反相色谱定性鉴别模型的验证[0060] 取杨梅素、金合欢素、金对草黄素、异鼠李素四种黄酮类化合物标准品，按照“1?7项下”操作，并将测定的Et值代入到“8项下”的数学模型中，计算Lnk′(T)值，与lnk′(E)值比较，计算二者之间的相对误差D值，结果见表1。由表1可见，4种用于验证数学模型的黄酮类化合物理论计算值lnk′(T)与实验值lnk′(E)之间的相对误差均小于5％，证明该模型可用于黄酮类化合物的鉴别。[0061] 实施例2四种单羟基取代黄酮同分异构体的鉴别[0062] 取7?羟基黄酮，6?羟基黄酮，3?羟基黄酮，5?羟基黄酮四种单羟基取代黄酮类化合物标准品，按照实施例“1?7项下”操作，并将测定的Et值代入到实施例“8项下”的数学模型中，计算lnk′(T)值，与lnk′(E)值比较，计算二者之间的相对误差D值，结果见表2。由表2可见，该方法可以用于单羟基黄酮同分异构体的鉴别，结果准确可靠。[0063] 表2四种单羟基取代黄酮同分异构体鉴定结果[0064][0065] 本说明书中的实施例采用递进的方式描述，实施例1重点说明了本鉴别方法可准确鉴定黄酮类化合物，实施例2重点说明了本鉴别实验可用于区分黄酮类化合物的同分异构体。各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。[0066] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

专利地区：黑龙江

专利申请日期：2023-01-10

专利公开日期：2024-08-02

专利公告号：CN115963207B