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专利名称：一种抗炎组合物

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202311335017.8

专利申请（专利权）人：内蒙古医科大学
权利人地址：内蒙古自治区呼和浩特市内蒙古医科大学新华校区教学实验综合楼1410室

专利发明（设计）人：陆景坤,那生桑

专利摘要：本发明公开了一种抗炎组合物，该组合物由沉香、肉豆蔻、阿魏和草果经CO2超临界萃取所得，具体地，萃取时，包括如下步骤：将沉香、肉豆蔻、阿魏和草果按比例混合后，粉碎，在压力10Mpa，萃取温度40℃，分离1压力7Mpa，分离2压力5Mpa的条件下萃取2小时；继续在压力15Mpa，萃取温度40℃，分离1压力7Mpa，分离2压力5Mpa的条件下继续萃取1小时，收集萃取物，即得。本发明的抗炎组合物能够显著降低Raw246.7细胞分泌NO，具有良好的抗炎效果，可用于心血管系统疾病炎症的治疗。

主权利要求：
1.一种抗炎组合物，其特征在于：该组合物由沉香、肉豆蔻、阿魏和草果的质量比为1：
6：1：4经CO2超临界萃取所得，萃取时，将沉香、肉豆蔻、阿魏和草果粉碎后，在压力10Mpa，萃取温度40℃，分离1压力7Mpa，分离2压力5Mpa的条件下萃取2小时；继续在压力15Mpa，萃取温度40℃，分离1压力7Mpa，分离2压力5Mpa的条件下继续萃取1小时，收集萃取物，即得。 说明书 : 一种抗炎组合物技术领域[0001] 本发明涉及药剂制备技术领域，具体涉及一种抗炎组合物。背景技术[0002] 炎症可发生在心血管系统疾病、自身免疫性疾病肿瘤等病理过程中,可见，炎症在各类疾病中占据重要地位。因此，保持体内炎症的动态平衡尤为重要。[0003] 肉豆蔻是蒙医特色药材，主治心赫依、心刺痛、谵语、晕厥、心慌等诸多心脏疾病且疗效很好。肉豆蔻的化学成分主要包括挥发油、脂肪油、苯丙素、木脂素和黄酮等，其中，肉豆蔻挥发油含量8％?15％，主要为单萜烃类、倍半萜烯类、芳香醚类、单萜醇类、酯类等；脂肪油含量25％?46％，主要为肉豆蔻科的特征成分二芳基壬酮类。[0004] 沉香是常用贵细药材，味辛、苦，性凉，有抑赫依，清热，止痛，利呼吸之功效。沉香含有色酮类、挥发油类、脂肪酸类和甾体类衍生物等多种化学成分，其中，挥发油是沉香的主要有效成分群及芳香物质，具有抗氧化、抑菌、镇痛、镇静、抗炎及抗癌等多种药理活性，因为其独特的香气，同时被广泛用于香水工业、宗教仪式等领域，具有很高的经济价值。[0005] 阿魏，伞形科阿魏属多年生草本植物，其化学成分十分丰富，主要含有挥发油、树脂、树胶、多糖等，其中，含挥发油约10％?17％、树脂约40％?64％、树胶约25％。阿魏的特征性化学成分有倍半萜、挥发油、香豆素、苯丙素，其中，倍半萜化合物多以酯、内酯的形式存在，并多具有生物活性，蒙医用其镇静止痛。[0006] 草果为姜科豆蔻属多年生草本植物，具有祛胃脾寒“赫依”，开胃，消食之功效。草果含挥发油，挥发油中的1，8?桉油素具有驱风、镇静、抗菌、抗病毒、杀灭寄生虫及发汗作用，为草果的有效成分之一；挥发油中的α?松油醇、香叶醇、橙花叔醇有明显的镇静、抗菌作用。发明内容[0007] 为解决上述问题，本发明提供了一种抗炎组合物，具有良好的抗炎作用。[0008] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：[0009] 一种抗炎组合物，该组合物由沉香、肉豆蔻、阿魏和草果经CO2超临界萃取所得，其中，CO2超临界萃取的压力为10～20Mpa，温度为40～50℃，分离1压力为6～8Mpa，分离2压力为4～6Mpa。[0010] 进一步地，该抗炎组合物萃取时，包括如下步骤：将沉香、肉豆蔻、阿魏和草果按比例混合后，粉碎，在压力10Mpa，萃取温度40℃，分离1压力7Mpa，分离2压力5Mpa的条件下萃取2小时；继续在压力15Mpa，萃取温度40℃，分离1压力7Mpa，分离2压力5Mpa的条件下继续萃取1小时，收集萃取物，即得。[0011] 其中，沉香、肉豆蔻、阿魏和草果的质量比为1：6：1：4。[0012] 本发明的抗炎组合物能够显著降低Raw246.7细胞分泌NO，具有良好的抗炎效果，可用于心血管系统疾病炎症的治疗。附图说明[0013] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：[0014] 图1为分段萃取物对Raw246.7细胞炎症模型NO分泌的影响；[0015] 图中：A为不同萃取物细胞毒试验，B为不同萃取物对NO分泌的影响，(x±s,n＝6)。[0016] 图2为二氧化碳萃取物总离子流图。[0017] 图3为10MPa?30min萃取物总离子流图。[0018] 图4为10MPa?1h萃取物总离子流图。[0019] 图5为10MPa?1.5h萃取物总离子流图。[0020] 图6为15MPa?30min萃取物总离子流图。[0021] 图7为15MPa?1h萃取物总离子流图。[0022] 图8为20MPa?30min萃取物总离子流图。[0023] 图9为20MPa?1h萃取物总离子流图。具体实施方式[0024] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。[0025] 试验材料[0026] (1.1)正交实验优化CO2超临界萃取工艺[0027] (1.1.1)仪器与材料[0028] 超临界萃取设备(上海戴普机械设备有限公司，型号：GKSF220?50?6L型)，肉豆蔻(安国市久旺药业有限公司，批号：19092603)，草果(安国市远光药业有限公司，批号：018190201)，阿魏(亳州市抱朴药业有限责任公司，批号：20210524AW?SW)，沉香(亳州市抱朴药业有限责任公司，批号：JC2018023)。[0029] (1.1.2)正交试验优化萃取工艺因素水平表[0030] 根据沉香、肉豆蔻、阿魏和草果四味药材中主要成分的理化性质及文献报道，本试验拟考察萃取压力、萃取温度、分离1压力和分离2压力四个因素对醇提工艺的影响，每个因素设计3个水平，见表1。[0031] 表1萃取工艺正交试验因素水平表[0032][0033] (1.1.3)正交试验结果[0034] 按质量比为1:6:1:4的比例称取沉香、肉豆蔻、阿魏和草果四味药材，共九份，按正交设计表进行CO2超临界萃。占腿∥，称重。以萃取物的重量为评价指标，结果见表2。[0035] 表2萃取工艺正交试验结果[0036][0037] 表3萃取工艺正交试验方差分析结果[0038][0039] 由表3可知，根据极差(R)大。范ˋ因素(萃取压力)对萃取工艺影响最大，其他三个因素对萃取工艺的影响较小。通过4因素3水平K值分析比较可知，萃取压力A3＞A2＞A1，萃取温度B3＞B1＞B2，分离1压力C2＞C3＞C1，分离2压力D2＞D1＞D3。根据方差分析表1?16可知，A因素对萃取有显著性影响，B、C、D三个因素对萃取均无显著性影响(P＞0.05)。综上所述，超临界萃取最优工艺条件为A3B3C2D2，即萃取压力为20Mpa，萃取温度为50℃，分离1压力为7Mpa，分离2压力为5Mpa。[0040] (1.1.4)最优萃取工艺放大验证试验[0041] 根据最佳工艺萃取工艺，即萃取压力为20Mpa，萃取温度为50℃，分离1压力为7Mpa，分离2压力为5Mpa，开展萃取工艺放大试验，结果见表4。三批药材的平均提取率为20.5％，提取率的RSD值为5.64％，实验结果说明CO2超临界萃取工艺稳定可靠。[0042] 表4放大验证试验结果(n＝3)[0043][0044] (1.2)分段萃取物谱效关系研究[0045] 基于正交实验优化萃取工艺结果结合实际生产的客观条件，且萃取物在后半段提取固体粉末状油脂较多的客观情况，可以得出萃取量的大小不能完全代表药材药效活性成分萃取完整程度，应结合萃取条件中的最大影响因素，即萃取压力及时间进行分段提。攵苑侄屋腿∥锝幸┬а笛檠橹，进行成分和谱效关系分析，进一步优化萃取工艺。[0046] 因此，将最佳萃取工艺中萃取温度、分离1压力和分离2压力参数进行固定，采用不同萃取压力和时间点来采集萃取物，利用GC?MS技术检测分析不同压力条件下不同时段的萃取物成分，同时取各萃取物样本干预体外Raw246.7细胞NO炎症模型，通过化学成分与活性筛选相结合的谱效关系研究进一步优化最佳萃取工艺条件。[0047] (1.2.1)试验仪器与材料[0048] GC?MS(EXPEC型号5250三重四级杆质谱仪?GC2000型)(内蒙古医科大学金山校区H楼三楼316室)，气相色谱柱(安捷伦?HP5MS,0.25mm)，超临界萃取设备(上海戴普机械设备有限公司GKSF220?50?6L型)，CO2培养箱(ThermoHERACELL150i)，离心机(湖南湘仪,TDZ5?WS)，酶标仪(Thermo)，倒置显微镜(OLYMPUS,CKS53)。肉豆蔻(安国市久旺药业有限公司19092603)，草果(安国市远光药业有限公司018190201)，阿魏(亳州市抱朴药业有限责任公司，20210524AW?SW)，沉香(安国市荣华本草中药材有限公司C32720120)。Raw264.7小鼠巨噬细胞购自中国科学院上海生命研究院，CCK8试剂盒(biosharp,BS350B)，脂多糖(北京colaber开云优惠体育网页版入口有限公司)，胎牛血清(PAN，德国)，NO试剂盒(碧云天，上海)，双抗(Gibco，USA)。甲苯(天津市凤船化学试剂开云优惠体育网页版入口有限公司?分析纯)，丙酮(天津市永大化学试剂开发中心?分析纯)。[0049] (1.2.2)分段萃取工艺参数设计及结果[0050] 根据正交实验获得的最佳萃取工艺条件，重新设计萃取工艺研究的参数，具体如下：萃取温度为40℃，分离1压力为7Mpa，分离2压力为5Mpa，萃取压力及萃取物收集时间段见表5。[0051] 表5分段萃取工艺参数设计表[0052][0053] 按照表5开展沉香、肉豆蔻、阿魏和草果四味药材的萃取试验，得到分段萃取物。常温下，分段萃取物样本的状态按时间顺序分别为液态、半固体、固体粉末，色泽依次为棕色、浅黄色、黄色、白色。[0054] (1.2.3)分段萃取物药理作用研究[0055] 1)混合萃取物对Raw246.7细胞毒的研究[0056] 将各分段萃取物水浴加热融化后，分别取10g，等量混合，搅拌均匀后，为混合萃取物，备用。[0057] 将Raw246.7细胞接种到96孔板，接种密度为5*104/孔，DMEM高糖培养基(10％FBS)培养24h后。加入不同浓度的混合萃取物干预24h后，CCK8试剂孵育1.5h，450nm波长下检测吸光度值，考察混合萃取物对Raw246.7细胞的毒性作用，以确定后续细胞实验的安全剂量。实验结果显示：混合萃取物随浓度增加，细胞毒性依次增大，其中7.8125μg/ml、15.625μg/ml两个浓度的混合萃取物细胞毒性最。悸禽腿∥镂淳赋ξ，直接干预细胞，因此拟选7.8125μg/ml、15.625μg/ml进行后续细胞实验的给药剂量，结果见表6。[0058] 表6混合萃取物细胞毒实验结果(x±s,n＝5)[0059][0060] 注：与空白组相比，“#”代表P<0.05,“##”代表P<0.01[0061] 2)混合萃取物对Raw246.7细胞炎症模型NO分泌的影响[0062] 将Raw246.7细胞接种到96孔板，接种密度为5*104/孔，DMEM高糖培养基(10％FBS)培养24h后。细胞随机分为空白组、LPS模型组，以及不同浓度混合萃取物干预组。LPS模型组用LPS干预，混合萃取物干预组在LPS干预后再加入不同浓度混合萃取物处理，24h后，取上清，NO试剂盒分析各组细胞上清液中NO含量，考察混合萃取物对Raw246.7细胞分泌NO的抑制作用。实验结果显示：15.625μg/ml混合萃取物显著抑制NO分泌(P<0.05)，7.8125μg/ml混合萃取物组NO分泌量与模型组比较无显著差异。125?500μg/ml混合萃取物组中由于萃取物的细胞毒性大，细胞分泌的NO含量也非常低。31.25μg/ml和62.5μg/ml的混合萃取物能够促进NO分泌，其中62.5μg/ml浓度组上清液中NO含量太高，超出酶标仪检测限，所以无数据，结果见表7。结合细胞毒实验，发明人进一步确定选择7.8125μg/ml和15.625μg/ml两个浓度开展萃取物对细胞NO分泌影响的实验。[0063] 表7混合萃取物对NO分泌的影响(x±s,n＝3)[0064][0065] 注：“*****”表示62.5μg/ml组中细胞上清液中NO含量超出酶标仪检测限[0066] 3)分段萃取物对Raw246.7细胞炎症模型NO分泌的影响[0067] 将Raw246.7细胞接种到96孔板，接种密度为5*104/孔，DMEM高糖培养基(10％FBS)培养24h后。细胞随机分为空白组、LPS模型组，以及不同浓度的分段萃取物干预组。模型组用LPS干预，分段萃取物干预组在LPS干预后再加入两种浓度的分段萃取物处理，24h后，取上清，NO试剂盒分析各组细胞上清液中NO含量，考察分段萃取物对Raw246.7细胞分泌NO的抑制作用，考察分段萃取物对Raw246.7细胞分泌NO的抑制作用。[0068] 高(15.625μg/ml)、低(7.8125μg/ml)浓度分段萃取物细胞毒性试验结果见图1A。由图1A可见，高剂量(15.625μg/ml)组中，10MPa?0.5h、10MPa?1h、10MPa?1.5h、15MPa?1h、20MPa?0.5h对细胞增殖无显著影响，10MPa?2h、15MPa?0.5h抑制细胞增殖，20MPa?1h有促细胞增殖作用(P<0.05或P<0.01)。低剂量(7.8125μg/ml)组中，除10MPa?2h和15MPa?0.5h抑制细胞增殖，其他各组均有促细胞增殖作用。[0069] 高(15.625μg/ml)、低(7.8125μg/ml)浓度分段萃取物对NO分泌的影响见图1B,由图可知，10MPa?(0.5～2h)、15MPa?(0.5h、1h)各组高、低浓度组均显著降低NO含量。20MPa各组，除20MPa?0.5h高剂量组外，对NO含量无显著影响。上述结果说明：10MPa?(0.5～2h)、15MPa?(0.5h、1h)各组萃取物具有良好的药效，20MPa各组萃取物药理活性低。[0070] (1.2.4)分段萃取物化学成分分析[0071] 1)GC?MS分析条件[0072] 气相色谱条件：[0073][0074] 质谱条件：循环时间：0.525s；扫描间隔0.02s；开始质量35；结束质量600；驻留时间0.5s离子模式化：EI；扫描模式：MS1Scan。[0075] 样本前处理：[0076] 2)结果[0077] 各种萃取物样品经GC?MS联用分析，得到总离子流图。其中按照正交实验得到的最佳萃取工艺获得的萃取物(A)总离子流图见图2，萃取物(A)所得各组分质谱数据经与NIST08数据库进行检索，依据拟合相似度最高值识别特征成分，并结合相关文献进行图谱分析，共识别挥发油成分54种，结果见表8。[0078] 各分段萃取物的GC?MS总离子流图分别见图3到图9。从图中可见，能检测到的化合物随萃取时间依次减少，15MPa?30min样品至20MPa?1h样品的GC?MS图谱仅显示出很少的挥发性成分。[0079] 表8GC?MS检测分析正交优化工艺萃取物(A)成分[0080][0081][0082][0083] (1.2.5)最优萃取工艺放大验证试验[0084] 按质量比为1:6:1:4比例称取沉香、肉豆蔻、阿魏、草果药材三份，根据上述萃取工艺参数，即在10Mpa压力，40℃萃取温度，7Mpa分离1压力，5Mpa分离2压力条件下，萃取2小时；在在15Mpa压力，40℃萃取温度，7Mpa分离1压力，5Mpa分离2压力条件下，继续萃取1小时，开展萃取工艺放大试验，结果见表9。三批药材的平均提取率为11.5％,提取率的RSD值为1.26％，实验结果说明CO2超临界萃取工艺稳定可靠。[0085] 表9放大验证试验结果(n＝3)[0086][0087] (1.2.6)小结[0088] 正交试验结果显示沉香、肉豆蔻、阿魏、草果的最佳萃取条件为：压力20Mpa，萃取温度40℃，分离1压力7Mpa，分离2压力5Mpa。但是，按照该工艺参数获得的萃取物含有大量固态的长链脂肪酸。文献报道，长链脂肪酸药理活性偏低，无药用价值，所以应该尽量去除长链脂肪酸。[0089] 在固定萃取温度40℃，分离1压力7Mpa，分离2压力5Mpa这三个参数，梯度设置萃取压力后，可以很好的将长链脂肪酸分离出来，进而去除，该工艺稳定可行，适用于大规模生产。[0090] 药效试验结果显示：10MPa和15MPa各时间段得到的萃取物均显著降低炎症模型细胞的NO分泌量。20MPa各时间段得到的萃取物无显著的药理活性。该实验结果证明固态的长链脂肪酸药理活性偏低，无药用价值，可以去除。[0091] GC?MS联用分析结果显示：10MPa和15MPa各时间段得到的萃取物中的挥发性成分的种类多、含量高，20MPa各时间段得到的萃取物中的挥发性成分的种类少、含量低。该实验结果证明20MPa压力条件下得到的固态的萃取物挥发性成分少，可以去除。[0092] 综上所述，沉香、肉豆蔻、阿魏、草果的最佳萃取工艺条件为：在10Mpa压力，40℃萃取温度，7Mpa分离1压力，5Mpa分离2压力条件下，萃取2小时；继续在15Mpa压力，40℃萃取温度，7Mpa分离1压力，5Mpa分离2压力条件下，继续萃取1小时，收集萃取物，即可。[0093] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

专利地区：内蒙古

专利申请日期：2023-10-16

专利公开日期：2024-07-26

专利公告号：CN117298233B