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专利名称：一种与青稞耐冻害胁迫相关的HOVUSG0964800基因及其用途

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310642100.3

专利申请（专利权）人：西藏自治区农牧科学院农业研究所,武汉轻工大学
权利人地址：西藏自治区拉萨市城关区金珠西路157号

专利发明（设计）人：杨春葆,许从萍,羊海珍,旺姆,顿珠加布,巴桑玉珍,曾兴权,徐齐君,王玉林,原红军

专利摘要：本发明提供了一种与青稞耐冻害胁迫相关的HOVUSG0964800基因及其用途，属于基因工程技术领域，本发明HOVUSG0964800基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本发明发现青稞在遭遇冻害胁迫后，青稞中HOVUSG0964800基因的表达急剧增加，且耐冻害青稞的表达水平显著高于冻害敏感型青稞。将HOVUSG0964800在烟草中进行过表达后，发现烟草叶片中多种脂质积累水平显著增加，且过表达烟草在冷处理后，相对电导率较野生型显著降低。因此，基因HOVUSG0964800在植物抵御冻害胁迫中具有重要的意义。

主权利要求：
1.核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的基因片段、包含核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的基因片段的重组载体、包含核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的基因片段的重组载体的重组菌或氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的耐冻害蛋白在制备耐冻害的植物中的用途；
所述植物为青稞和/或烟草。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述重组载体是重组表达载体pEAQ。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述重组菌为重组农杆菌EHA105。
4.一种耐冻害的转基因植物的构建方法，其特征在于：取核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的基因片段，转入植物中，获得表达氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的蛋白的植株；
所述转基因植物为转基因烟草。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述转入植物的方法是农杆菌法、基因枪法、电转法、PEG介导法、脂质体法和磷酸钙?DNA共沉淀法中的一种。 说明书 : 一种与青稞耐冻害胁迫相关的HOVUSG0964800基因及其用途技术领域[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种与青稞耐冻害胁迫相关的HOVUSG0964800基因及其用途。背景技术[0002] 低温伤害是农业生产中一种最严重的自然灾害,也是西北农作物区域性分布和季节性生长的主要限定因素，因而筛选抗寒型品种是提高作物产量的重要方法。已有研究结果表明，农作物在低温冻害锻炼过程中，膜保护酶活性、细胞质膜透性和抗氧化剂、碳水化合物、脂类、蛋白质和核酸等代谢物质会发生显著的改变。这些物质均参与植物抵御抗寒的生理过程，与植物的抗寒能力密切的相关。[0003] 青稞属于禾本科(Gramineae)大麦属(Hordeum)作物,是大麦(HordeumvulgareL.)的变种群,又称裸大麦，具有独特的耐寒特性,某些品种的苗期可以耐?9.0～?7.3℃的低温。青海省栽培青稞的3叶生长期在每年的4～5月,易受天气突然变化影响，导致严重的减产。[0004] 因此，研究青稞耐冻害相关基因有重要意义。发明内容[0005] 本发明的目的在于提供一种耐冻害胁迫相关的HOVUSG0964800基因及其用途。[0006] 本发明提供了一种基因片段，其特征在于：所述基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。[0007] 本发明还提供了一种重组载体，其特征在于：所述重组载体包含核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的基因片段。[0008] 进一步地，所述重组载体是重组表达载体pEAQ。[0009] 本发明还提供了一种重组菌，其特征在于：所述重组菌包含上述的重组载体。[0010] 进一步地，所述重组菌为重组农杆菌EHA105。[0011] 本发明还提供了一种耐冻害蛋白，其特征在于：所述耐冻害蛋白的氨基酸序列如EQIDNO.2所示。[0012] 本发明还提供了上述的基因片段、上述的重组载体、上述的重组菌或上述的耐冻害蛋白在制备耐冻害的植物的用途；所述植物优选为青稞、烟草。[0013] 本发明还提供了一种耐冻害的转基因植物的构建方法，其特征在于：取核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的基因片段，转入植物中，获得表达氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的蛋白的植株，即可。[0014] 进一步地，所述转基因植物为转基因烟草。[0015] 进一步地，所述转入植物的方法是农杆菌法、基因枪法、电转法、PEG介导法、脂质体法和磷酸钙?DNA共沉淀法中的一种。[0016] 本发明首次发现了青稞中的一种新的耐冻害胁迫相关的HOVUSG0964800基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；该耐冻害胁迫相关的HOVUSG0964800基因表达的蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明发现HOVUSG0964800基因，可以提高青稞耐冻害能力。并且本发明将该基因转移到烟草中，使得烟草植株中表达HOVUSG0964800基因，在HOVUSG0964800基因过表达烟草受到冻害胁迫时，发现提高了烟草中脂质积累量，同时提高了烟草的耐冻害能力。本发明提供的新的基因，及其重组载体、重组菌、转基因植物均具有良好的应用前景。[0017] 本发明的新的基因，及其重组载体、重组菌可以用来提高青稞耐冻害胁迫能力，提高了青稞的耐冻害能力。[0018] 本发明的转基因植物构建方法，为青稞的耐冻害改良提供了重要的参考。[0019] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。[0020] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明[0021] 图1为不同低温胁迫下，耐寒冻型青稞(A)和温度敏感型青稞(B)中HOVUSG0964800基因表达量分析。注：24℃为正常生长温度。[0022] 图2与对照组相比，烟草瞬时超表达HOVUSG0964800基因后，多种脂质含量显著提高(A)；HOVUSG0964800基因过表达OE组(实验组)和WT组(对照组：野生型)下，相对电导率变化对比(B)。具体实施方式[0023] 本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。[0024] 本申请发现了一种新的与耐冻害胁迫相关的转录因子(HOVUSG0964800基因)，该基因序列如SEQIDNO.1所示，该基因可以通过常规的基因合成手段直接合成，也可以采用其他常规方式制备。[0025] SEQIDNO.1：[0026] ATGGACATGGGCGAGGTCTCGAGCTCTCCCCCCTCCTCTTCCAACGAG[0027] AACGCGTCGGGACGGTCGTCGACGGCCAAGCGCCCGGCGGGGCGCAC[0028] TAAGTTCCGCGAGACAAGGCACCCGGTGTACCGCGGCGTGCGGCGCCG[0029] GGGCAACGCCGAACGGTGGGTATGCGAGGTGCGCGTCCCCGGCAAGC[0030] GCGGCGCTCGGCTCTGGCTCGGGACTTACGCCACGGCCGAGATCGCAG[0031] CGCGCGCGAACGATGCCGCAATGCTCGCCCTGGGCGGCCGCTCCGCCG[0032] CGCGCCTCAACTTCTCGGACTCCGCGTGGCTGCTCGCCGTGCCGTCCG[0033] CGCACTCCGATCTCGCCGACGTCCGGCGCGCGGCGGTCGAGGCCGTCT[0034] CGGATTTGCAGCGACGGGAGGCTGCCGGTGGGTCCATCAGCGCCACGG[0035] TCGACGAGGAGGCCTCCTGTGGCGCTCCTGCAGAATCGTCGTCTGAGT[0036] CTGACGGTGCCGGCTCGTCGGAGACGTCGAAACCTTCCGCGGATGGAG[0037] ACTTGGCGGTACCGGTCGGAATGGACATCGAAATGTTCAGGCTTGACTT[0038] CTTCCCGGAAATGGAGTTTGGCTCGTACTACGCGAGCCTCGCGGAGGC[0039] GCTGCTGATGGACCCGCCGCCGGTGGCGAACAGCACGGGCGCGTACTG[0040] GGATAACGGAGAATTCGGGGAGGTGGCAA[0041] CCGAGTTCGCGCTGTGGAGCTAG[0042] SEQIDNO.2：[0043] MDMGEVSSSPPSSSNENASGRSSTAKRPAGRTKFRETRHPVYRGVRRRGN[0044] AERWVCEVRVPGKRGARLWLGTYATAEIAARANDAAMLALGGRSAARL[0045] NFSDSAWLLAVPSAHSDLADVRRAAVEAVSDLQRREAAGGSISATVDEEA[0046] SCGAPAESSSESDGAGSSETSKPSADGDLAVPVGMDIEMFRLDFFPEMEFG[0047] SYYASLAEALLMDPPPVANSTGAYWDNGEFGEVATEFALWS[0048] 实施例1、HOVUSG0964800基因在耐冻害青稞中的表达[0049] 一、实验方法[0050] 对青稞品种进行筛。秆〉玫侥投澈Φ那囡分趾投澈γ舾械那囡。将两种不同抗性级别的青稞幼苗(4周龄)，分别在24(青稞正常生长的温度)、12、5、0、?5，?8℃的环境下生长24h。[0051] 测定方法：采集上述六种温度处理后的叶片通过RNA?seq对HOVUSG0964800的表达量进行分析。[0052] 二、实验结果[0053] 结果如图1，耐冻害青稞中HOVUSG0964800在正常温度(24℃)基本不表达，然而在0℃和?5℃的低温胁迫下，HOVUSG0964800的表达明显增加，分别为130.0和227.3。冻害敏感型青稞同样在0℃以上时，HOVUSG0964800基因几乎不表达，在0℃和?5℃的低温胁迫下HOVUSG0964800的表达量分别仅为62.3和108.2。[0054] 可见在0～?5℃低温胁迫下，耐冻害青稞HOVUSG0964800的表达增量约是冻害敏感型青稞的2倍。[0055] 实验结果说明，在低温时耐冻害青稞中HOVUSG0964800表达明显高于冻害敏感型青稞品种，HOVUSG0964800的表达能提高青稞耐冻害能力。[0056] 实施例2HOVUSG0964800基因瞬时表达对烟草耐冻害的影响[0057] 一、实验方法[0058] (一)含有目标基因的表达载体烟草的制备方法：[0059] 1、烟草材料[0060] 4?5周大的本氏烟草(Nicotianabenthamiana)[0061] 2、含有目标基因的表达载体烟草的制备过程：[0062] ①将含有目标基因(基因序列如SEQIDNO.1所示)的瞬时表达载体(瞬时表达载体pEAQ，来自JohnInnesCentre)转化农杆菌(EHA105)；[0063] ②挑取阳性农杆菌克隆于500μl含有相应抗生素(kn)的LB中，培养20?24小时；[0064] ③转接200μl于5ml含有相应抗生素(kn)的LB中，28℃摇床220rpm至吸光率(OD)＝2.0左右。[0065] ④10000rpm常温离心2min收集菌体，用提前配制转化缓冲液进行菌体的重悬，摇床震荡3h；缓冲液工作液成分以及浓度如下：10mMMES(pH5.7)，10mMMgCl2，100μUDP?葡萄糖。[0066] ⑤拿准备好的1ml的注射器，去掉针头，选取出口光滑的注射器吸入菌液，取1月龄的本氏烟草(Nicotianabenthamiana)，用手按住叶片，从叶片反面注射，使农杆菌渗透进去。给烟草注射过的地方做好标记，可在叶片上圈出农杆菌渗透的区域，并选取注射了转化缓冲液的烟草做对照。[0067] ⑥注射了农杆菌的烟草黑暗培养24h，然后移至烟草培养箱中光照培养24?48小时即可取样(注意注射的烟草不可直接在叶片上喷洒水)。[0068] (二)检测方法[0069] 1、产物收集和纯化[0070] 剪取农杆菌渗透区域的叶片，放在已称重的装有钢珠的EP管中，做好标记后，迅速放置液氮中，进行冻干。冻干后的样本，利用研磨仪(MM400,Retsch)在30Hz条件下研磨60s得到样品粉末，将样本粉末装入2mlEP管内。[0071] 用电子天平称取每个EP管的重量并记录；将已研磨好的样本取适量(范围30?60mg)于EP管中，称量并记录，算出所有EP管中样本的净重。[0072] 已知每份样本的净重，按体积V＝样本净重(mg)*12μL/mg在4℃冰上操作加入70％甲醇(MeOH)溶液。混匀，涡旋15s，每隔半小时涡旋一次，共涡旋4次，放4℃冰箱内提取12h以上，得到样品提取液。[0073] 先将离心机开机预冷到4℃，设置时间10min和转速12000rpm，将样本涡旋后放入离心，使用离心机注意对称平衡，离心后吸取上清液，得到样品提取液上清液。将上清液用微孔滤膜(0.22μmporesize)过滤，得到样品过滤液，装入上样瓶中，准备液相色谱质谱联用仪(LC?MS)检测。[0074] 2、目的产物检测[0075] 1)脂质含量检测[0076] 将装有样品过滤液的进样瓶放入自动进样器内的样品盘，并记录每个进样瓶编号所对应的进样孔位置。同时打开软件AnalystSoftware，双击HardwareConfiguration，选择LCMS?V(有切换阀模式)，点击ActivateProfile，并选择AcquireMode模式，点击Acquire，点击图上方的Equilibrate键，一般设定时间为3min，此操作目的是预热仪器，使高压输液泵、色谱柱、柱温箱、离子源温度等达到方法中设置的条件。待各仪器部件状态Ready后，功能区StartSample键成为可点击状态，此时表明仪器正常，分析条件正常，然后点击StartSample开始跑样，首次跑样前先提交4针空白样。[0077] 2)相对电导率(Electrolyteleakage,EL)检测：[0078] 采集经冻害胁迫处理后的植株上的新鲜叶片，用去离子水冲洗干净，滤纸吸干后分别放在一个含有20毫升ddH2O的微量离心管中，以离心管中装满相同体积的水作为空白对照。[0079] 测试样品和空白对照管在室温下在摇床(中国)上摇晃1h(20rpm)，然后使用电导率计(DSS?307，SPSIC，中国)测量样品的初始电导率(C1)和空白对照的初始电导率(CK1)。然后将试管煮沸10min，并在室温下冷却，然后煮沸后的测试样品电导率(C2)和空白对照电导率(CK2)。[0080] 最后测试样品的相对电导率，采用公式C(％)＝(C1?CK1)/(C2?CK2)×100来计算。[0081] 2、结果[0082] 实验结果说明，本发明将基因HOVUSG0964800转移到烟草中，诱导烟草积累了多种脂质，包括9HOTrE、14,15?Dehydrocrepenynicacid、9,10?EODE、Punicicacid、LysoPC18:3、LysoPE14:0、LysoPC15:0、LysoPE16:0和LysoPC16:0，13?HPODE(图2A)；其中LysoPC16:0提升最为明显。[0083] 电导率变化幅度越。参锟购芰υ角，即本发明中的相对电导率越。参锟购芰υ角。[0084] 可从图2B中看出，在冻害胁迫下，过表达植株(OE组)的相对电导率显著低于野生型(WT)，表明HOVUSG0964800可通过调控脂质的积累正向调控青稞的抗寒性。[0085] 综上，本发明研究发现在冻害胁迫后，HOVUSG0964800基因表达急剧增加，并诱导烟草积累多种脂质，显著调控青稞抗性品种中脂质的积累水平从而提高青稞的耐冻害能力。将基因HOVUSG0964800在烟草中进行过表达后，烟草叶片中脂质的含量显著增加，烟草耐冻害能力提高。因此，HOVUSG0964800基因在植物抵御冻害胁迫中具有重要的意义。

专利地区：西藏

专利申请日期：2023-05-31

专利公开日期：2024-05-31

专利公告号：CN116622734B