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专利名称：叶酸生产菌株及其制备和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202080059788.7

专利申请（专利权）人：赤峰制药股份有限公司
权利人地址：内蒙古自治区赤峰市红山区赤峰红山高新技术产业开发区赤药路1号

专利发明（设计）人：施明安,孙佳,孙向宇,邵菲,蔡志刚,张国银,M·布拉奇克,T·科杰,G·科赛科,S·福尔斯,A·库萨克,J·霍瓦特

专利摘要：本发明提供了一种叶酸生产菌株及其制备和应用，特别是降低了本发明工程菌株中内源性folC基因的表达水平，引入外源性folC基因，与出发菌株相比，工程菌株中叶酸、其前体或其中间体的生产能力显著提高。

主权利要求：
1.一种用于合成叶酸、其盐、其前体或其中间体的基因工程菌株，其中所述工程菌株中内源性folC基因的表达水平降低，并且引入外源性folC基因并且所述工程菌株与其出发菌株相比具有显著提高的叶酸、其前体或其中间体的生产能力，叶酸、其盐、其前体或其中间体的结构式如式I所示：其中，当a为单键时，a’为无或当a’为单键时，a为无；
当b是单键时，b′是无或当b′是单键时，b是无；
R1选自下组：?H、?CH3(5?甲基)、?CHO(5?甲酰基)、?CH＝或＝CH?(5，10?亚甲基)、?CH2?(5，10?亚甲基)、?CH＝NH(5?亚胺甲基)、或其组合；
R2选自下组：?H、?CHO(10?甲酰基)、?CH＝、＝CH?(5，10?亚甲基)、?CH2?(5，10?亚甲基)、或其组合，所述外源性folC基因来源于棉囊阿舒霉或罗伊氏乳杆菌，所述外源性folC基因的序列如SEQIDNO.：24或25所示；所述工程菌株的出发菌株为枯草芽孢杆菌；
并且还引入或上调叶酸生物合成基因，所述叶酸生物合成基因为folE/mtrA、folB、folK、folP/sul和folA/dfrA，所述叶酸生物合成基因的序列分别如SEQIDNO.13?17所示，叶酸生物合成基因来自枯草芽孢杆菌。
2.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，外源性folC基因的表达产物包含选自下组的多肽或其衍生多肽：二氢叶酸合酶。
3.如权利要求2所述的基因工程菌株，其特征在于，二氢叶酸合酶的氨基酸序列如SEQIDNO.：22或23所示。
4.一种叶酸、其盐、其前体或其中间体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(i)提供权利要求1所述的工程菌株；
(ii)培养步骤(i)所述的工程菌株，从而获得含有叶酸、其盐、其前体或其中间体的一种或多种化合物的发酵产物；
(iii)任选地，对步骤(ii)中得到的发酵产物进行分离纯化，进一步获得叶酸、其盐、其前体或其中间体的一种或多种化合物；
(iv)任选地，将步骤(ii)或(iii)中得到的产物经酸性或碱性条件进一步得到叶酸、其盐、其前体或其中间体的不同化合物；
其中叶酸、其盐、其前体或其中间体的结构式如式I所示：
并且R1、R2、a、a′、b、b′如权利要求1中所定义。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，叶酸、其盐、其前体或其中间体是叶酸。
6.一种制备叶酸、其前体或其中间体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(i)提供权利要求1所述的工程菌株；
(ii)培养步骤(i)所述的工程菌株，从而得到含叶酸的发酵产物；
(iii)任选地，对步骤(ii)中得到的发酵产物进行分离纯化，进一步得到叶酸、其前体或其中间体。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤(ii)的培养过程中添加对氨基苯甲酸(PABA)的步骤。
8.一种权利要求1所述的工程菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)降低出发菌株中内源性folC基因的表达水平，并引入所述外源性folC基因；
所述方法还包括在出发菌株中引入或上调叶酸生物合成基因的步骤(b)，所述叶酸生物合成基因为folE/mtrA、folB、folK、folP/sul和folA/dfrA，所述叶酸生物合成基因的序列分别如SEQIDNO.13?17所示，叶酸生物合成基因来自枯草芽孢杆菌；从而获得权利要求
1所述的工程菌株。
9.一种权利要求1所述的工程菌株的用途，其用作用于发酵生产叶酸、其盐、其前体或其中间体的工程菌株；
其中叶酸、其盐、其前体或其中间体的结构式如式I所示：
并且R1、R2、a、a′、b、b′如权利要求1中所定义。 说明书 : 叶酸生产菌株及其制备和应用技术领域[0001] 本发明涉及生物技术工程领域，具体涉及一种产生叶酸的菌株及其制备和应用。[0002] 背景[0003] 叶酸是叶酸及其多种衍生物的总称；它们在氧化状态、蝶啶环的单碳取代和γ?连接的谷氨酸残基的数量上有所不同(如图1所示)。叶酸的蝶啶部分可以以三种氧化状态存在：完全氧化(叶酸)，或还原的7,8?二氢叶酸(DHF)，或5,6,7,8?四氢叶酸(THF)(参见结构式I)。THF是维生素的共酶活性形式，它接受、转移和提供C1基团，这些C1基团连接在N5或N10位置或通过桥接这些位置。C1基团的氧化态也不同，叶酸以甲酸衍生物(5?甲酰基?THF(5?FTHF或亚叶酸)、10?甲酰基?THF、5,10?亚甲基?THF和5?forminino?THF)、甲醇(5?甲基?THF)或甲醛(5,10?亚甲基?THF)。此外，大多数天然存在的叶酸以γ?连接的聚谷氨酸结合物的形式存在。[0004] 叶酸(蝶酰?L?谷氨酸)是一种合成化合物，自然界中不存在。叶酸作为辅酶没有活性，必须在细胞内经过几个代谢步骤才能转化为具有代谢活性的THF形式。然而，叶酸是商业上最重要的叶酸化合物，工业上通过化学合成生产。哺乳动物不能合成叶酸，并依赖膳食补充剂来维持叶酸的正常水平。低叶酸状态可能是由于饮食摄入量低、摄入叶酸吸收不良以及由于遗传缺陷或药物相互作用引起的叶酸代谢改变。大多数国家已经通过叶酸补充剂或强化食品确定了叶酸的推荐摄入量。膳食补充剂中使用的叶酸包括叶酸、亚叶酸(5?FTHF、甲酰四氢叶酸)或5?MTHF(Scaglione和Panzavolta2014)。目前生产两种盐形式的5?MTHF作为补充剂。默克密理博生产 一种5?MTHF的钙盐，它是一种稳定的结晶形式，是天然存在的主要叶酸形式。GnosisS.p.A.开发了一种(6S)?5?MTHF的氨基葡萄糖盐并获得了专利，品牌名为[0005] 目前，叶酸在工业上主要是通过化学合成生产的，而与其他维生素不同，由于当前细菌菌株产生的叶酸产量低，工业规模的微生物叶酸生产并未得到利用(Rossi等人，2016年)。虽然化学产生的叶酸不是天然存在的分子，但人类能够通过二氢叶酸还原酶(DHFR)的作用将其代谢成生物活性形式的叶酸。有几个原因支持用微生物发酵替代化学合成方法来商业化生产叶酸：首先，还原形式的叶酸可以由微生物产生，人类可以更有效地利用。最重要的是，原则上，单步发酵过程比多阶段化学过程更高效、更环保。[0006] 以前的研究已经完成以阐明微生物中叶酸的产生。大多数用于生产叶酸的微生物应用仅限于发酵乳制品的强化和产生叶酸的益生菌。还进行了培养条件的优化以提高叶酸的合成，达到约150μg/g的叶酸产量(Hjortmo等人，2008；Sybesma等人，2003b)。一些研究已经描述了乳酸菌(Sybesma等人，2003a)、酵母菌(Walkey等人，2015年)或丝状真菌(Serrano?Amatriain等人，2016年)的转基因菌株，它们能够产生叶酸，滴度高达6.6mg/L。另一种成功用于微生物生产叶酸的方法是在对氨基苯甲酸(pABA)存在下培养酵母或细菌菌株。在这些培养物的上清液中测得总叶酸含量高达22mg/L。[0007] 因此，迫切需要开发一种新的叶酸生产菌株，以提高叶酸、其盐、其前体或其中间体的生产能力。发明内容[0008] 本发明的目的是提供一种产生叶酸的菌株及其制备和应用。[0009] 在本发明的第一方面，提供了一种用于合成叶酸、其盐、其前体或其中间体的基因工程菌株，其中所述工程菌株中内源性folC基因的表达水平降低，并且引入外源folC基因并且所述工程菌株与其出发菌株相比具有显著提高的叶酸、其前体或其中间体的生产能力。[0010] 在另一优选实施方式中，叶酸、其盐、其前体或其中间体的结构式如式I所示：[0011][0012] 其中，当a为单键时，a’为无或当a’为单键时，a为无；[0013] 当b是单键时，b'是无或当b'是单键时，b是无；[0014] R1选自下组：?H、?CH3(5?甲基)、?CHO(5?甲酰基)、?CH＝或＝CH?(5,10?亚甲基)、?CH2?(5,10?亚甲基)、?CH＝NH(5?亚胺甲基)、或其组合；[0015] R2选自下组：?H、?CHO(10?甲酰基)、?CH＝、＝CH?(5,10?亚甲基)、?CH2?(5,10?亚甲基)、或其组合。[0016] 在另一个优选的实施方式中，所述工程菌株的出发菌株选自下组：大肠杆菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、无名假丝酵母和棉囊阿舒霉。[0017] 在另一个优选的实施方案中，所述工程菌株的出发菌株包括枯草芽孢杆菌。[0018] 在另一个优选的实施方案中，所述基因工程菌株是细菌。[0019] 在另一个优选的实施方案中，所述基因工程菌株是芽孢杆菌属的细菌。[0020] 在另一个优选的实施方案中，所述基因工程菌株是枯草芽孢杆菌的细菌。[0021] 在另一个优选的实施方案中，内源folC基因的表达水平降低是指与出发菌株(野生型)相比，所述工程菌株中内源性folC基因的表达水平降低至少50％，优选降低至少60％、70％、80％、90％或100％。[0022] 在另一个优选的实施方案中，外源性folC基因来源于棉囊阿舒霉或罗伊氏乳杆菌。[0023] 在另一个优选的实施方案中，外源性folC基因的表达产物包含选自下组的多肽或其衍生多肽：二氢叶酸合酶(DHFS?EC6.3.2.12)。[0024] 在另一个优选的实施方案中，二氢叶酸合酶的氨基酸序列如SEQIDNO.:22或23所示。[0025] 在另一个优选的实施方案中，编码二氢叶酸合酶的多核苷酸序列如SEQIDNO.:24或25所示。[0026] 在另一个优选的实施方案中，外源性folC基因包括与外源性folC基因≥80％同一性的基因，优选≥90％，更优选≥95％，更优选≥98％，更优选≥99％(注：在核苷酸水平上)。[0027] 在另一个优选的实施方案中，外源性folC基因如SEQIDNO.:24或25所示。[0028] 在另一个优选的实施方案中，所述二氢叶酸合酶包含与SEQIDNO：22或23的具有至少70％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。[0029] 在另一个优选实施方式中，“显著提高”是指与出发菌株相比，工程菌株的叶酸发酵产量至少大于0.01g/L，优选至少0.01?0.1g/L；更优选地，至少0.1?1g/L，根据发酵液的体积，每升；和/或[0030] “显著提高”是指与出发菌株相比，工程菌株的叶酸生产能力增加或提高100％；优选200?50000％。[0031] 在另一个优选的实施方案中，“显著提高”是指与出发菌株相比，工程菌株中的叶酸生产能力增加或提高至少50％，例如至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少2000％、至少5000％、至少10000％、至少20000％或至少50000％，与起始菌株相比。[0032] 在另一个优选实施方案中，在工程菌株中引入或上调编码叶酸生物合成酶的基因。[0033] 在另一个优选的实施方案中，上调是指与出发菌株(野生型)相比，在引入或上调叶酸生物合成基因的工程菌株中，叶酸生物合成基因的表达水平增加至少80％，更优选增加至少100％、200％、300％、400％、500％、600％或800％。[0034] 在另一个优选的实施方案中，上调是指与出发菌株(野生型)相比，在引入或上调叶酸生物合成基因的工程菌株中，与出发菌株(野生型)相比，叶酸生物合成基因的表达水平具有至少50％，例如至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少2000％、至少5000％、至少10000％、至少20000％或至少50000％。[0035] 在另一个优选的实施方案中，叶酸生物合成基因选自下组：folE/mtrA、folB、folK、folP/sul、folA/dfrA、或其组合。[0036] 在另一个优选的实施方案中，叶酸生物合成基因是选自folE/mtrA、folB、folK、folP/sul、folA/dfrA的至少一种基因(例如至少两种、至少三种、至少四种或至少五种基因)。[0037] 在另一个优选的实施方案中，叶酸生物合成基因来源于细菌或真菌，优选选自芽孢杆菌属、乳球菌属和阿舒囊霉属。[0038] 在另一个优选的实施方案中，叶酸生物合成基因来自细菌，优选来自芽孢杆菌属物种的细菌，最优选来自枯草芽孢杆菌或乳酸乳球菌或棉阿舒囊霉。[0039] 在另一个优选的实施方案中，叶酸生物合成基因的表达产物包含选自下组的多肽或其衍生物：GTP环化水解酶、7,8?二氢新蝶呤醛缩酶、2?氨基?4?羟基?6?羟甲基二氢蝶啶焦磷酸激酶、二氢蝶酸合酶、二氢叶酸还原酶、或其组合。[0040] 在另一个优选的实施方案中，叶酸生物合成基因的表达产物是至少一种参与叶酸生物合成的酶。[0041] 在另一个优选的实施方案中，参与叶酸生物合成的至少一种酶对于基因工程微生物是异源的。[0042] 在另一个优选的实施方案中，参与叶酸生物合成的至少一种酶来源于细菌或真菌，优选选自芽孢杆菌属、乳球菌属、希瓦氏菌属、弧菌属和阿舒囊霉属。[0043] 在另一个优选的实施方案中，参与叶酸生物合成的至少一种酶来源于枯草芽孢杆菌、乳酸乳杆菌、紫色希瓦氏菌(Shewanellaviolacea)、需钠弧菌(Vibrionatriegens)或棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)。[0044] 在另一个优选的实施方案中，具有GTP环化水解酶活性的多肽包含与SEQIDNO:7具有至少70％、例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。[0045] 在另一个优选的实施方案中，具有7,8?二氢新蝶呤醛缩酶活性的多肽包含与SEQIDNO:8具有至少70％、例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少具有98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。[0046] 在另一个优选的实施方案中，具有2?氨基?4?羟基?6?羟甲基?二氢蝶啶焦磷酸激酶活性的多肽包含与SEQIDNO:9具有至少70％、例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。[0047] 在另一个优选的实施方案中，具有二氢蝶酸合酶活性的多肽包含与SEQIDNO:10具有至少70％、例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少至少99％的序列同一性的氨基酸序列。[0048] 在另一个优选的实施方案中，具有二氢叶酸还原酶活性的多肽包含与SEQIDNO:12具有至少70％、例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。[0049] 在另一个优选的实施方案中，GTP环化水解酶的氨基酸序列如SEQIDNO.:7所示。[0050] 在另一个优选的实施方案中，GTP环化水解酶的编码序列如SEQIDNO.：1所示。[0051] 在另一个优选的实施方案中，7,8?二氢新蝶呤醛缩酶氨基酸序列如SEQIDNO.：2所示。[0052] 在另一个优选的实施方案中，7，8?二氢新蝶呤醛缩酶的编码序列如SEQIDNO.：8所示。[0053] 在另一个优选的实施方案中，2?氨基?4?羟基?6?羟甲基二氢蝶啶焦磷酸激酶的氨基酸序列如SEQIDNO.:3所示。[0054] 在另一个优选的实施方案中，2?氨基?4?羟基?6?羟甲基二氢蝶啶焦磷酸激酶的编码序列如SEQIDNO.:9所示。[0055] 在另一个优选的实施方案中，二氢蝶酸合酶的氨基酸序列如SEQIDNO.:4所示。[0056] 在另一个优选的实施方案中，二氢蝶酸合酶的编码序列如SEQIDNO.:10所示。[0057] 在另一个优选的实施方案中，二氢叶酸还原酶的氨基酸序列如SEQIDNO.:6所示。[0058] 在另一个优选的实施方案中，二氢叶酸还原酶的编码序列如SEQIDNO.:12所示。[0059] 在另一个优选的实施方案中，工程菌株通过以下方法获得：[0060] (a)降低出发菌株中内源性folC基因的表达水平和/或活性，并引入外源性folC基因。[0061] 在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括在出发菌株中引入或上调叶酸生物合成基因的步骤(b)。[0062] 在另一个优选的实施方案中，生产能力包括：发酵产量(生产率)。[0063] 在第二方面，提供了一种叶酸、其盐、其前体或其中间体的制备方法，包括以下步骤：[0064] (i)提供权利要求1所述的工程菌株；[0065] (ii)培养步骤(i)所述的工程菌株，从而获得含有叶酸、其盐、其前体或其中间体的一种或多种化合物的发酵产物；[0066] (iii)任选地，对步骤(ii)中得到的发酵产物进行分离纯化，进一步获得叶酸、其盐、其前体或其中间体的一种或多种化合物；[0067] (iv)任选地，将步骤(ii)或(iii)中得到的产物经酸性或碱性条件进一步得到叶酸、其盐、其前体或其中间体的不同化合物；[0068] 其中叶酸、其盐、其前体或其中间体的结构式如式I所示：[0069][0070] 并且R1、R2、a、a'、b、b'如上定义。[0071] 在另一个优选的实施方案中，叶酸、其盐、其前体或其中间体是叶酸。[0072] 另一方面，提供了一种制备叶酸、其前体或其中间体的方法，包括以下步骤：[0073] (i)提供权利要求1所述的工程菌株；[0074] (ii)培养步骤(i)所述的工程菌株，从而得到含叶酸的发酵产物；[0075] (iii)任选地，对步骤(ii)中得到的发酵产物进行分离纯化，进一步得到叶酸、其前体或其中间体。[0076] 在另一个优选的实施方案中，叶酸、其盐、其前体或其中间体的结构式如式I所示：[0077][0078] 其中，当a为单键时，a’为无或当a’为单键时，a为无；[0079] 当b是单键时，b'是无或当b'是单键时，b是无；[0080] R1选自下组：?H、?CH3(5?甲基)、?CHO(5?甲酰基)、?CH＝或＝CH?(5,10?亚甲基)、?CH2?(5,10?亚甲基)、?CH＝NH(5?亚胺甲基)、或其组合；[0081] R2选自下组：?H、?CHO(10?甲酰基)、?CH＝、＝CH?(5,10?亚甲基)、?CH2?(5,10?亚甲基)、或其组合。[0082] 在另一个优选的实施方案中，工程菌株的培养温度为32?42℃，优选34?39℃，更优选36?39℃，例如约37℃。[0083] 在另一个优选的实施方案中，工程菌株的培养时间为10?70h，优选24?60h，更优选36?50h。[0084] 在另一个优选的实施方案中，工程菌株培养的pH为6?8，优选6.5?7.5，更优选6.8?7.2。[0085] 在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括在步骤(ii)的培养过程中添加对氨基苯甲酸(PABA)的步骤。[0086] 在另一个优选的实施方案中，对氨基苯甲酸(PABA)选自下组：对氨基苯甲酸钾、对氨基苯甲酸钠、对氨基苯甲酸甲酯、对氨基苯甲酸乙酯、对氨基苯甲酸丁酯、或其组合。[0087] 在另一个优选的实施方案中，进一步包括将步骤(i)或(ii)或(iii)中得到的产物置于酸性或碱性条件下，进一步得到衍生化合物。[0088] 在第三方面，提供了本发明第一方面所述的工程菌株的制备方法，包括以下步骤：[0089] (a)降低出发菌株中内源性folC基因的表达水平，并引入外源性folC基因，从而获得权利要求1所述的工程菌株。[0090] 在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括在出发菌株中引入或上调叶酸合成调控基因的步骤(b)。[0091] 在另一个优选实施方式中，所述方法包括以下步骤：[0092] (a1)敲除宿主细胞中的内源性folC基因；[0093] (b1)培养所述宿主细胞；和[0094] 所述方法包括以下步骤：[0095] (a2)提供携带外源性folC基因的表达载体；[0096] (b2)将所述表达载体转入到宿主细胞中；[0097] (c2)培养所述宿主细胞。[0098] 在另一个优选的实施方案中，所述载体是质粒、粘粒或核酸片段。[0099] 在第四方面，提供了本发明第一方面所述的工程菌株的用途，其用作用于发酵生产叶酸、其盐、其前体或其中间体的工程菌株。[0100] 在第五方面，提供了一种基因工程微生物，优选细菌或酵母，其已被修饰为i)与其他方面相同的微生物(参考微生物)相比，编码具有二氢叶酸合酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的多肽的内源基因的表达水平降低，和ii)表达仅具有二氢叶酸合酶活性的异源多肽。[0101] 在另一个优选的实施方案中，与其他相同的微生物相比，内源性基因的表达水平降低至少50％，例如降低至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。[0102] 在另一个优选的实施方案中，编码具有二氢叶酸合酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的多肽的内源基因已经失活。[0103] 在另一个优选的实施方案中，编码具有二氢叶酸合酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的多肽的内源基因已通过部分或整个基因序列的缺失而失活。[0104] 在另一个优选的实施方案中，编码具有二氢叶酸合酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的多肽的内源基因是基因folC。[0105] 在另一个优选的实施方案中，编码具有二氢叶酸合酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的多肽的内源基因是内源基因folC。[0106] 在另一个优选的实施方案中，编码具有二氢叶酸合酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的多肽的内源基因包含与SEQIDNO:5所示的核酸序列具有至少70％、例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的核酸序列。[0107] 在另一个优选的实施方案中，由内源基因编码的同时具有二氢叶酸合酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的多肽包含与SEQIDNO:11所示的氨基酸序列具有至少70％、例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。[0108] 在另一个优选的实施方案中，仅具有二氢叶酸合酶活性的异源多肽来源于细菌或真菌，优选地选自罗伊氏乳杆菌和棉阿舒囊霉。[0109] 在另一个优选的实施方案中，仅具有二氢叶酸合酶活性的异源多肽包含与SEQIDNO:22或23的具有至少70％、例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。[0110] 在另一个优选的实施方案中，与其他方面相同的微生物(参考微生物)相比，基因工程微生物已被进一步修饰以具有显著提高的叶酸、其前体或其中间体的生产能力。[0111] 在另一个优选的实施方案中，与其他方面相同的微生物相比，叶酸、其前体或其中间体的生产能力增加至少50％，例如至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少2000％、至少5000％、至少10000％、至少20000％或至少50000％。[0112] 在另一个优选的实施方案中，与其他方面相同的微生物相比，基因工程微生物已被进一步修饰以具有增加的至少一种基因(例如至少两种、至少三种、至少四种或至少五种基因)的表达水平，该基因编码参与叶酸生物合成的酶。[0113] 在另一个优选的实施方案中，与其他方面相同的微生物相比，编码参与叶酸生物合成的酶的至少一种基因(例如至少两种、三种、四种或五种基因)的表达水平增加至少50％，例如至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少2000％、至少5000％、至少10000％、至少20000％或至少50000％。[0114] 在另一个优选的实施方案中，编码参与叶酸生物合成的酶的至少一种基因选自下组：folE/mtrA、folB、folK、folP/sul和folA/dfrA。[0115] 在另一个优选的实施方案中，参与叶酸生物合成的酶选自下组：具有GTP环化水解酶活性的多肽、具有7,8?二氢新蝶呤醛缩酶活性的多肽、具有2?氨基?4?羟基?6?羟甲基二氢蝶啶焦磷酸激酶活性的多肽、具有二氢蝶酸合酶活性的多肽和具有二氢叶酸还原酶活性的多肽。[0116] 在另一个优选的实施方案中，编码参与叶酸生物合成的酶的至少一种基因对于基因工程微生物是异源的。[0117] 在另一个优选的实施方案中，编码参与叶酸生物合成的酶的至少一种基因来源于细菌或真菌，优选选自芽孢杆菌属、乳球菌属和阿舒囊霉属。[0118] 在另一个优选的实施方案中，所述至少一种编码参与叶酸生物合成的酶的基因来源于选自枯草芽孢杆菌、乳酸乳杆菌和棉阿舒囊霉的细菌或真菌。[0119] 在另一个优选的实施方案中，与其他方面相同的微生物相比，基因工程微生物已被进一步修饰以具有增加的参与叶酸生物合成的至少一种酶(例如至少两种、至少三种、至少四种或至少五种酶)的表达水平。[0120] 在另一个优选的实施方案中，所述至少一种参与叶酸生物合成的酶选自下组：具有GTP环化水解酶活性的多肽、具有7,8?二氢新蝶呤醛缩酶活性的多肽、具有2?氨基?4?羟基?6?羟甲基二氢蝶啶焦磷酸激酶活性的多肽、具有二氢蝶酸合酶活性的多肽和具有二氢叶酸还原酶活性的多肽。[0121] 在另一个优选的实施方案中，参与叶酸生物合成的至少一种酶对于基因工程微生物是异源的。[0122] 在另一个优选的实施方案中，参与叶酸生物合成的至少一种酶来源于细菌或真菌，优选选自芽孢杆菌属、乳球菌属、希瓦氏菌属、弧菌属和阿舒囊霉属。[0123] 在另一个优选的实施方案中，参与叶酸生物合成的至少一种酶来源于枯草芽孢杆菌、乳酸乳杆菌、紫色希瓦氏菌(Shewanellaviolacea)、需钠弧菌(Vibrionatriegens)或棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)。[0124] 在另一个优选的实施方案中，具有GTP环化水解酶活性的多肽包含具有与SEQIDNO:7的至少70％、例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少至少99％的序列同一性的氨基酸序列。[0125] 在另一个优选的实施方案中，具有7,8?二氢新蝶呤醛缩酶活性的多肽包含与SEQIDNO:8具有至少70％、例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少具有98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。[0126] 在另一个优选的实施方案中，具有2?氨基?4?羟基?6?羟甲基?二氢蝶啶焦磷酸激酶活性的多肽包含与SEQIDNO:9具有至少70％、例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。[0127] 在另一个优选的实施方案中，具有二氢蝶酸合酶活性的多肽包含与SEQIDNO:10具有至少70％、例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少至少99％的序列同一性的氨基酸序列。[0128] 在另一个优选的实施方案中，具有二氢叶酸还原酶活性的多肽包含与SEQIDNO:12具有至少70％、例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。[0129] 在另一个优选的实施方案中，基因工程微生物是细菌。[0130] 在另一个优选的实施方案中，基因工程微生物是芽孢杆菌属的细菌。[0131] 在另一个优选的实施方案中，基因工程微生物是枯草芽孢杆菌的细菌。[0132] 在第六方面，提供了一种制备叶酸或其盐、其前体或其中间体的方法，包括i)在培养基中，在合适的培养条件下培养本发明第五方面所述的基因工程微生物以获得含有所述叶酸、其前体或其中间体的发酵产物；ii)任选地，分离和/或纯化所述叶酸、其前体或其中间体。[0133] 在另一个优选的实施方案中，步骤i)在32至42℃，优选34至39℃，更优选36至39℃，例如约37℃的培养温度下进行。[0134] 在另一个优选的实施方案中，步骤i)进行10至70小时，优选24至60小时，更优选36至50小时的时间。[0135] 在另一个优选的实施方案中，其中步骤i)在pH为6至8，优选6.5至7.5，更优选6.8至7.2的范围内进行。[0136] 在另一个优选的实施方案中，叶酸或其盐、其前体或其中间体是式I化合物：[0137][0138] 其中，当a为单键时，a’为无或当a’为单键时，a为无；[0139] 当b是单键时，b'是无或当b'是单键时，b是无；[0140] R1选自下组：?H、?CH3(5?甲基)、?CHO(5?甲酰基)、?CH＝或＝CH?(5,10?亚甲基)、?CH2?(5,10?亚甲基)和?CH＝NH(5?亚胺甲基)；[0141] R2选自下组：?H、?CHO(10?甲酰基)、?CH＝、＝CH?(5,10?亚甲基)和?CH2?(5,10?亚甲基)。[0142] 在另一个优选的实施方案中，还包括在培养步骤(i)中添加对氨基苯甲酸(PABA)的步骤。[0143] 在另一个优选的实施方案中，对氨基苯甲酸(PABA)选自：对氨基苯甲酸钾、对氨基苯甲酸钠、对氨基苯甲酸甲酯、对氨基苯甲酸乙酯、对氨基苯甲酸丁酯、或其组合。[0144] 在另一个优选的实施方案中，还包括将步骤(i)或(ii)中得到的产物置于酸性或碱性条件下，进一步得到衍生化合物。[0145] 在另一个优选的实施方案中，包括以下步骤：(a)与其他方面相同的微生物(参考微生物)相比，降低编码具有二氢叶酸合酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的多肽的内源基因的表达水平，和b)表达仅具有二氢叶酸合酶活性的异源多肽。[0146] 在另一个优选的实施方案中，包括以下步骤：aa)失活所述微生物中编码具有二氢叶酸合酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的多肽的内源基因，例如通过删除部分或整个基因序列；和/或bb)将包含编码仅具有二氢叶酸合酶活性的异源多肽的核酸序列的外源核酸分子引入所述微生物中。[0147] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明[0148] 图1显示了叶酸的核心结构。在天然叶酸中，蝶呤环以四氢形式(如图所示)或7,8?二氢形式存在。该环在化学产生的叶酸中被完全氧化。叶酸通常具有与第一个谷氨酸相连的最多约8个残基的γ连接的聚谷氨酰尾。一个碳单元(甲酰基、甲基等)可以与N5和/或N10位置偶联，从而合成5?甲酰基叶酸、10?甲酰基叶酸或5?甲基叶酸。[0149] 图2显示了由乳酸乳球菌基因组成的叶酸操纵子示例的示意图。[0150] 图3显示了由棉阿舒囊霉(A.gossypii)基因组成的叶酸操纵子示例的示意图。[0151] 图4显示了由枯草芽孢杆菌基因组成的叶酸操纵子示例的示意图。[0152] 图5显示了在Pveg启动子下具有四环素抗性基因(TetR)、异源folC2?LR或folC2?AG基因的FolC干扰表达盒的示意图，侧翼同源末端用于天然folC靶基因的破坏。用于DNA干扰表达盒的PCR扩增的引物的位置用线表示。[0153] 图6显示了10?甲酰基叶酸标准品的色谱图。黑色：UV信号，红色：MS/MS信号。[0154] 图7显示了在CE20V下源自m/z470的SRM片段。[0155] 图8显示了5?甲酰基?THF标准品的色谱图。黑色：UV信号，红色：MS/MS信号。[0156] 图9显示了在CE20V下源自m/z474的SRM片段。[0157] 图10显示了5?甲基?THF标准品的色谱图。黑色：UV信号，红色：MS/MS信号。[0158] 图11显示了在CE20V下源自m/z460的SRM片段和发酵液样品的色谱图。黑色：UV信号，红色：MS扫描信号。[0159] 图12显示了在CE20V下源自m/z472的SRM片段。在RT＝10分钟的新峰的特性被确定为10?二氢?甲酰基叶酸。[0160] 图13显示了发酵液样品的色谱图。黑色：UV信号，红色：MS扫描信号。[0161] 图14显示了10?甲酰基二氢叶酸在氧气存在下氧化成10?甲酰基叶酸的示意图，10?甲酰基二氢叶酸在过氧化氢存在下氧化成10?甲酰基叶酸的示意图和在高碘酸钠存在下10?甲酰基二氢叶酸氧化成10?甲酰基叶酸的示意图。[0162] 图15显示了10?甲酰基叶酸在酸性介质中脱甲酰基为叶酸的示意图。[0163] 图16显示了10?甲酰基叶酸在碱性介质中脱甲酰基为叶酸的示意图。[0164] 图17显示了叶酸生产的生物过程概况。叶酸(mg/L)：满星；葡萄糖浓度(g/L)：空方块；乙偶姻浓度(g/L)：全方块；PABA浓度(mg/L)：空心圆圈；PABA进料(mg/L)：竖线；光密度：整圆。[0165] 图18显示了枯草芽孢杆菌菌株w.t.168、菌株VBB38、菌株FL21和FL23在摇床5ml放大实验的总叶酸生产滴度。[0166] 详述[0167] 经过广泛深入的研究和大量筛。⒚魅艘馔獾胤⑾，如果在出发菌株中降低内源性folC基因的表达水平，同时引入外源性folC基因，并且在生物合成的叶酸上只添加了一种谷氨酸，叶酸、其盐、其前体或其中间体的生产能力显著提高。此外，本发明人还发现，在出发菌株中引入或上调叶酸生物合成基因(例如，folE/mtrA、folB、folK、folP/sul、folA/dfrA)也可以显著提高叶酸、其盐、其前体或其中间体的生产能力。发明人还意外地发现，在如上所述获得的菌株的培养过程中添加对氨基苯甲酸(PABA)可以显著进一步提高叶酸、其盐、其前体或其中间体的生产能力。在此基础上，发明人完成了本发明。[0168] 如本文所用，“异源”是指多肽通常不在宿主生物中发现或由宿主生物制造(即表达)，而是源自不同物种。[0169] 如本文所用，“失活”是指所讨论的基因不再表达功能性蛋白质。由于部分或整个基因序列的缺失、基因阅读框的移位、错义/无义突变的引入，或基因邻近区域的修饰，包括控制基因表达的序列，例如启动子、增强子、弱化子、核糖体结合位点等，修饰的DNA区域可能无法自然表达基因。优选地，目的基因因部分或整个基因序列的缺失而失活，例如通过基因替换。[0170] 可以通过PCR、Southern印迹等众所周知的方法检测细菌染色体上基因的存在与否。此外，可以通过使用各种众所周知的方法测量从基因转录的mRNA量来估计基因表达水平，包括Northern印迹、定量RT?PCR等。该基因编码的蛋白质的量可以通过公知的方法进行测定，包括SDS?PAGE，然后进行免疫印迹分析(Western印迹分析)等。[0171] 在本发明中，术语“基因工程菌株”和“基因工程微生物”可以互换使用。[0172] 出发菌株[0173] 如本文所用，术语“本发明的出发菌株”或“本发明的出发微生物”可以互换使用，是指在其基因组中编码具有二氢叶酸合酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的多肽的任何细菌或真菌，例如任何芽孢杆菌属物种，例如枯草芽孢杆菌。[0174] 在一个优选的实施方案中，出发菌株从工业微生物遗传和选择研究所的俄罗斯国家工业微生物保藏中心获得或购买，编号为VKPMB?2116，通用交叉名称为VNIIGenetika?304或VBB38。[0175] 本发明的出发菌株的生理和生化特性是：核黄素生物合成的失调、嘌呤碱基生物合成的失调、在8?氮鸟嘌呤存在下生长的能力，在玫瑰黄色素存在下生长的能力。[0176] 应当理解，出发菌株不仅包括编号为VKPMB?2116的菌株。该菌株还包括其衍生菌株。[0177] 叶酸、其盐、其前体或其中间体[0178] 在本发明中，叶酸、其盐、其前体或其中间体如式I所示：[0179][0180] 其中，当a为单键时，a’为无或当a’为单键时，a为无；[0181] 当b是单键时，b'是无或当b'是单键时，b是无；[0182] R1选自下组：?H、?CH3(5?甲基)、?CHO(5?甲酰基)、?CH＝或＝CH?(5,10?亚甲基)、?CH2?(5,10?亚甲基)、?CH＝NH(5?亚胺甲基)、或其组合；[0183] R2选自下组：?H、?CHO(10?甲酰基)、?CH＝、＝CH?(5,10?亚甲基)、?CH2?(5,10?亚甲基)、或其组合。[0184] 叶酸是B族维生素中的一种重要维生素，广泛用于食品和动物饲料的强化以及膳食补充剂的生产。叶酸通常在怀孕期间被女性用作补充剂，以降低婴儿神经管缺陷的风险。长期补充也与中风和心血管疾病风险的小幅降低有关。[0185] “叶酸”是用于命名多种维生素形式的术语，即叶酸及其同系物，包括四氢叶酸(维生素的活化形式)、甲基四氢叶酸(血清中的主要形式)、亚甲基四氢叶酸、亚叶酸，和叶酸。[0186] 传统的叶酸生产基于化学合成。主要三种成分，2,4,5?三氨基?6?羟基嘧啶、1,1,3?三氯丙酮和N?(4?氨基苯甲酰基)?L?谷氨酸经酸沉碱精制缩合生成蝶酸单谷氨酸盐。这种叶酸化学生产工艺存在收率低、产生大量废水、环境污染严重等缺点。[0187] 发明人发现，通过对出发菌株进行基因工程改造，可以显著提高该菌株中叶酸、其盐、其前体或其中间体的生产能力。[0188] 本发明的“叶酸、其盐、其前体或其中间体的生产能力”是指叶酸类化合物、其盐、其前体或其中间体的生产能力，即其相当于其前体或其中间体的“工业生产等级”、“工业潜力”、“工业生产能力”、“生产能力”，可以互换使用，指发酵产量至少为0.01g/L，优选至少0.05–0.1g/L；更优选至少0.5?1g/L，以发酵液的总体积计的在此范围内的任意整数和非整数值，在此不再赘述。[0189] 本发明的实验表明，本发明的基因工程菌株(如枯草芽孢杆菌)显著提高了叶酸及其盐、其前体或其中间体的合成能力，摇瓶实验产量可达333mg/L。在野生型菌株(如枯草芽孢杆菌)中，叶酸及其前体或其中间体的合成能力很低，产量只能达到0.31mg/L。这是非常出乎意料的。[0190] folC基因[0191] 在一些细菌，例如枯草芽孢杆菌中，向二氢蝶酸(二氢叶酸合成酶(DHFS)活性，EC6.3.2.12)添加L?谷氨酸，随后通过γ羧基向四氢叶酸添加L?谷氨酸(叶酰聚谷氨酸合成酶(FPGS)活性，EC6.3.2.17)，由相同的酶FolC催化。相反，在真核生物和其他一些细菌中，DHFS和FPGS酶活性编码在不同的基因中。与许多其他细菌一样，枯草芽孢杆菌将γ连接的聚谷氨酸尾巴添加到叶酸中，以增加溶解度并防止这种必需的辅因子流失到环境中。因此，枯草芽孢杆菌FolC具有叶酰聚谷氨酸合成酶(FPGS)活性，除了在叶酸从头生物合成途径中作为二氢叶酸合酶的作用外，它还通过其γ?羧基催化叶酸的聚谷氨酰化。叶酸聚阴离子不能输出细胞，导致细胞内滞留增强(Sybesma等，2003c)。此外，FPGS酶的产物叶酰聚谷氨酸是叶酸生物合成酶的强抑制剂(McGuire和Bertino，1981)。因此，为了增加叶酸的产量，我们通过敲除天然folC基因，并将其替换为仅编码必需二氢叶酸合成酶(DHFS)活性的异源性folC基因，取消了叶酸的聚谷氨酰化，导致添加只有一个必需的谷氨酸部分。仅具有二氢叶酸合成酶(DHFS)而没有叶酰聚谷氨酸(FGPS)合成酶活性的FolC同源物可以在许多细菌物种如罗伊氏乳杆菌和许多真核生物如棉阿舒囊霉中找到。[0192] 叶酸生物合成基因[0193] 在本发明中，叶酸生物合成基因包括folE/mtrA、folB、folK、folP/sul和folA/dfrA。[0194] 叶酸分子包含一个蝶呤部分，源自鸟苷三磷酸(GTP)，与对氨基苯甲酸(pABA)和至少一个谷氨酸分子结合。因此，叶酸的从头生物合成需要三种前体：GTP、pABA和谷氨酸。[0195] 叶酸生物合成通过GTP在四个连续步骤中转化为6?羟甲基?7,8?二氢蝶呤焦磷酸盐(DHPPP)进行。第一步由GTP环化水解酶I(EC3.5.4.16)(基因folE/mtrA)催化，涉及GTP的广泛转化，形成蝶呤环结构。去磷酸化后，蝶呤分子经历醛缩酶(EC4.1.2.25)(基因folB)和焦磷酸激酶反应(EC2.7.6.3)(基因folK)，产生活化的焦磷酸化的DHPPP。在二氢蝶酸合酶(EC2.5.1.15)(基因folP/sul)催化下，对氨基苯甲酸(pABA)与DHPPP第一次缩合以产生二氢蝶酸。第二次缩合是谷氨酸与二氢蝶酸通过二氢叶酸合酶(DHFS)(EC6.3.2.12)(基因folC)反应形成二氢叶酸。然后，DHF被DHF还原酶?DHFR(EC1.5.1.3)(基因folA/dfrA)还原为具有生物活性的辅因子四氢叶酸(THF)。[0196] 本发明中叶酸生物合成基因的信息见表1。[0197] 表1.叶酸生物合成基因[0198][0199][0200][0201][0202] 工程菌株及其制备方法[0203] 本发明的“工程菌”、“工程菌株”和“基因工程菌株”可以互换使用，均指降低内源性folC基因的表达水平，以及引入外源性folC基因。在一个优选的实施方案中，叶酸合成调控基因(例如，folE/mtrA、folB、folK、folP/sul、folA/dfrA)也可以被引入或上调。[0204] 其中，本发明的工程菌株与出发菌株相比具有显著提高的叶酸、其前体或其中间体的生产能力，其中叶酸、其前体或其中间体的结构如式I所示。[0205] 可用于转化为本发明的工程菌株的出发菌株是属于芽孢杆菌属的菌株，特别是枯草芽孢杆菌。野生型出发菌株的叶酸、前体或中间体的合成能力较差(Zhu等，2005)，或不具备工业所需量的叶酸、其前体或其中间体的合成能力。本发明的工程菌经过基因改造后，仅将一种Glu残基添加到所产生的叶酸、其前体或其中间体中，从而增强了叶酸从细胞向发酵培养基的分泌表型，叶酸、其前体或其中间体的生产能力显著提高，或与出发菌株相比该能力大大提高。优选地，“显著增加”是指与其出发菌株相比，工程菌株中叶酸、其盐、其前体或其中间体的生产能力增强或增加至少100％，优选至少200?50000％。[0206] 此外，可以转化为本发明工程菌株的出发菌株还可以包括如下表3中的菌株。[0207] 本发明的工程菌株可以通过以下方法获得：[0208] (a1)敲除宿主细胞中的内源性folC基因；[0209] (b1)培养所述宿主细胞；和[0210] 该方法包括以下步骤：[0211] (a2)提供携带外源性folC基因的表达载体；[0212] (b2)将表达载体转入到宿主细胞中；[0213] (c2)培养所述宿主细胞；[0214] 其中宿主细胞是出发菌株。[0215] 在这里，我们可以有一个部分，即任何由枯草芽孢杆菌菌株产生的叶酸化合物，然后可以转化为不同的衍生物，特别是使用化学步骤并在下面的实施例中描述的叶酸。[0216] 药物组合物和施用方式[0217] 本发明菌株发酵产物中的叶酸或其前体或其中间体可用于制备药物。本发明的化合物可以施用于哺乳动物，例如人，并且可以口服、直肠、肠道外(静脉内、肌内或皮下)、局部等施用。这些化合物可以单独给药或与其他药学上可接受的化合物联合给药。应当注意，本发明的化合物可以组合给药。[0218] 用于口服给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与以下组分混合：(a)填充剂或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；(c)保湿剂，例如甘油；(d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、海藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠；(e)慢溶剂，例如石蜡；(f)吸收促进剂，例如季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如高岭土；(i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或它们的混合物。在胶囊、片剂和丸剂中，剂型还可以包含缓冲剂。[0219] 固体剂型如片剂、糖丸、胶囊、丸剂和颗粒剂可以用包衣和壳如肠溶衣和本领域已知的其他材料制备。它们可以含有遮光剂，并且活性化合物或此类组合物中的化合物的释放可以延迟方式在消化道的一部分中释放。可以使用的嵌入组分的例子是聚合物和蜡质材料。如有必要，活性化合物也可以与一种或多种上述赋形剂形成微胶囊化形式。[0220] 用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂或酏剂。除活性化合物外，液体剂型还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1、3?丁二醇、二甲基甲酰胺和油类，尤其是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物。[0221] 除了这些惰性稀释剂之外，组合物还可以含有助剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂和香料。[0222] 除了活性化合物外，悬浮液还可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和硝酸异山梨酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或它们的混合物等。[0223] 用于肠道外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌水溶液或非水溶液、分散体、悬浮液或乳液，以及用于重构为无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其合适的混合物。[0224] 用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、推进剂和吸入剂。将活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体和任何防腐剂、缓冲剂或，如果需要的话，推进剂混合。[0225] 当使用药物组合物时，将安全有效量的本发明化合物施用于需要治疗的哺乳动物(例如人)，其中剂量为药学有效剂量，用于60kg体重的个体，每日给药剂量通常为1?1000mg，优选20?500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、个体健康状况和其他因素，这些都在熟练医师的技能范围内。[0226] 本发明的主要优点包括：[0227] (1)通过本发明的方法进行基因工程改造的菌株在产生的叶酸、其盐、其前体或其中间体上仅添加一个Glu残基，从而增强了叶酸从细胞向发酵培养基的分泌表型，可显著提高叶酸及其前体或其中间体的生产能力；此外，该菌株的特点是叶酸生物合成基因过表达，进一步提高了生产能力；[0228] (2)工程菌株遗传稳定，不易突变；[0229] (3)工程菌株在标准发酵培养基中显示出与其他工业枯草芽孢杆菌菌株相当的生长。[0230] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，并不用于限制本发明的范围。以下实施例中未具体说明的实验方法的条件，通常按照Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的常规条件，或按照微生物学杂志中描述的条件：实验手册(由PearsonEducationPress的JamesCappuccino和NatalieSherman编辑)或制造商建议的条件。除非另有说明，百分比和份数均为重量百分比和重量份数。[0231] 除非另有说明，实施例中使用的材料均为市售产品。[0232] 实施例1：枯草芽孢杆菌基因组中叶酸生物合成基因的鉴定[0233] 参与叶酸生物合成途径的基因和酶在文献中是已知的，并且在KEGG数据库(www.genome.jp/kegg/pathway.html)中有详细描述。通过使用BLAST算法研究枯草芽孢杆菌的基因组和蛋白质数据库，获得了枯草芽孢杆菌关键叶酸生物合成基因的核苷酸和蛋白质序列。叶酸生物合成基因和酶的序列被引入作为“查询(query)”，相应的枯草芽孢杆菌序列被确定为“命中(hits)”。叶酸生物合成基因的序列列于如下表2中。[0234] 表2.枯草芽孢杆菌中参与叶酸生物合成的基因和酶[0235][0236] 实施例2：叶酸生物合成的合成基因的合成，针对枯草芽孢杆菌的优化[0237] 氨基酸序列(SEQIDNO：7、8、9、10和12)用于基因密码子优化(来自IDT集成DNA技术公司的密码子优化工具)以提高枯草芽孢杆菌中的蛋白质表达。合成的DNA片段(分别为SEQIDNO：13、14、15、16和17)设计为添加RBS序列、用于基因过表达的调节启动子序列(例如p15SEQIDNO：38)和进一步组装叶酸操纵子表达盒所需的两端短接头序列。[0238] 实施例3：叶酸操纵子的组装[0239] ·从枯草芽孢杆菌基因组装的叶酸操纵子[0240] 来自枯草芽孢杆菌基因的关键叶酸生物合成基因被合成为DNA片段(SEQIDNO：13、14、15、16和17)，用于组装叶酸操纵子(FOL?OP?BS2)。为了将叶酸操纵子整合到枯草芽孢杆菌基因组中，设计并合成了两个额外的具有lacA同源性和红霉素选择标记(SEQIDNO：18和19)的DNA片段，用于稳定的基因组整合。[0241] 在叶酸操纵子组装的第一步中，使用特定的引物组(引物对SEQIDNO:26和SEQIDNO:27用于片段SEQIDNO:13；引物对SEQIDNO::32和SEQIDNO:28用于片段SEQIDNO:17；引物对SEQIDNO:33和SEQIDNO:29用于片段SEQIDNO:15；引物对SEQIDNO:34和SEQIDNO:30对于片段SEQIDNO：16；用于片段SEQIDNO:14的引物对SEQIDNO:35和SEQIDNO:31)对单独的DNA片段进行PCR扩增。[0242] 使用Eppendorf循环仪和Phusion聚合酶(ThermoFisher)扩增片段，缓冲液由制造商提供，添加200μMdNTP、5％DMSO、每种引物0.5μM和大约20ng模板，最终体积为50μl，持续32循环。[0243] 使用的程序：98℃2分钟[0244] 32个循环(98℃30s、65℃15s、72℃30s)[0245] 72℃5分钟[0246] 10℃保持[0247] 每个片段的PCR在0.8％琼脂糖凝胶上进行，并通过Wizard PCR纯化试剂盒(Promega)中提供的方案从凝胶中纯化。通过重复的限制和连接步骤将片段组装成人工叶酸操纵子。使用了NdeI和AseI限制性位点的组合，以确保成功连接的兼容限制性末端。在每一步连接后，将合并的片段作为新的模板进行下一次PCR扩增。在50μl体积中进行限制，添加5μlFD绿色缓冲液、3μl选定酶和大约1500ngPCR片段。用WizardSV凝胶和PCR纯化系统(PCRClean?upsystem)限制后对片段进行纯化，前两个用于连接。我们使用2,5UT4DNA连接酶(ThermoFisher)和制造商提供的缓冲液，并添加5％PEG4000和两个片段，摩尔比为1:1，最终体积为15μl。在接下来的步骤中，将1μl灭活连接物用作新的50μLPCR中的模板，其中引物为SEQIDNO:26和SEQIDNO:28，使用相同的程序(具有更长的延伸时间)，并如上所用混合。在0.8％琼脂糖凝胶上进行PCR，从凝胶上切下片段并纯化(cleaned)。用Asel限制性内切酶切割纯化的新片段(SEQIDNO:13和SEQIDNO:17的组合)，并在与第三个片段(SEQIDNO:15)连接时使用的额外纯化后，已经用Ndel切割并在之后纯化。在对作为模板的连接物进行新PCR之后，我们还通过相同的方案添加了片段4和5，以制作多达5个叶酸生物合成基因的片段。[0248] 在进行总叶酸的培养测量后，将由枯草芽孢杆菌基因组装的构建的叶酸操纵子(如图4所示)用于转化(参见实施例5)以产生菌株FL722(参见实施例13)。[0249] ·来自乳酸乳球菌乳酸亚种乳酸乳球菌基因的叶酸操纵子[0250] 通过PCR扩增来自乳酸乳球菌乳酸亚种乳酸乳球菌操纵子FOL?OP?LL(SEQIDNO:49)的异源基因(folA、clpX、ysxL、folB、folE、folP、ylgG和folC)，并将分离的基因组DNA用作模板。用于PCR扩增的引物设计用于两个单独的PCR反应，其中第一个PCR反应引物(SEQIDNO:45和SEQIDNO:46)用于特异性扩增来自基因组DNA的基因，而第二个PCR反应引物(SEQIDNO：47和SEQIDNO：48)用于在操纵子的两端额外引入限制性位点(NheI和NotI)。将PCR产物亚克隆到低拷贝载体pFOL1中，并在FOL?OP?LL操纵子的起始处添加强组成型启动子P15(SEQIDNO:38)。为了构建FOL?OP?LL操纵子的整合盒，引入了氯霉素抗性盒和amyE基因座的下游同源性。最后一步，利用SbfI限制性内切酶从克隆载体实现整合盒，用于自连接，实现多拷贝基因组整合。从乳酸乳球菌乳酸亚种乳酸乳球菌基因组装的构建的叶酸操纵子(如图2所示)，用于转化以产生菌株FL84，在培养后进行总叶酸的测量(参见实施例13)。[0251] ·来自棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)(Eremotheciumgossypii)基因的叶酸操纵子[0252] 使用两种合成的叶酸生物合成基因fol1?AG(SEQIDNO:50)和fol2?AG(SEQIDNO：51)构建了来自已知的产生B2维生素的丝状真菌棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)(Eremotheciumgossypii)的表达盒(FOL?OP?AG)。针对枯草芽孢杆菌最佳表达，对基因进行密码子优化并合成为两个单独的DNA片段FOL1?AG(SEQIDNO:52)和FOL2?AG(SEQIDNO:53)，其中引入额外的调节启动子序列(启动子P15)。首先使用氯霉素抗性盒下游的SpeI/BamHI限制性位点和强组成型启动子P15将FOL1?AG片段亚克隆到低拷贝载体pFOL1中。在第二步中，使用EcoRV限制性位点将FOL2?AG片段亚克隆到amyE基因座同源性上游的低拷贝载体pFOL2中。在下一步中，使用引物(SEQIDNO:54和SEQIDNO:55)PCR扩增含有P15?fol2?AG和amyE同源性的DNA片段，并使用BamHI限制位点克隆到氯霉素抗性盒下游的质粒pFOL1和P15?fol1?AG。在最后的步骤中，使用引物(SEQIDNO：56和SEQIDNO：57)对组装的整合盒FOL?OP?AG进行PCR扩增，并将PCR产物用于细胞的转化。在进行总叶酸的培养测量后，将构建的由棉阿舒囊霉基因组装的叶酸操纵子(如图3所示)用于转化以产生菌株FL260(参见实施例13)。[0253] 实施例4：用于folC替换的遗传构建体的组装[0254] 为了用能够在叶酸生物合成中仅连接第一个谷氨酸残基的变体取代能够将多个谷氨酸残基连接到叶酸上的天然叶酰聚谷氨酸合成酶(folC)，我们着手生成相应的遗传构建体。folC干扰盒通过使用相应的引物对SEQ IDNO：43和SEQIDNO：44从gDNAB.subtilisVBB38通过PCR扩增的folC同源末端组装。PCR混合物由制造商提供的Phusion聚合酶(ThermoFisher)和缓冲液制成，添加5％DMSO、200μMdNTPs和0.5μM的每种引物至最终体积为50μL，共32个循环(退火温度65℃，延伸时间2分钟)。从0.8％琼脂糖凝胶上切下扩增的PCR片段，用Wizard凝聚和PCR纯化系统试剂盒纯化，并在制造商提供的缓冲液A中用T4多核苷酸激酶(ThermoFisher)磷酸化，添加1mMATP。[0255] 将制备的片段连接到低拷贝质粒pET?29c(Novagen)中，该质粒预先用FspA1和XhoI切割，用DNA聚合酶I、大(Klenow)片段(ThermoFisher)平末端并用FastAP热敏碱性磷酸酶(ThermoFisher)去磷酸化。[0256] 四环素抗性盒(SEQIDNO：21)用于破坏folC基因序列。通过用Bsp119l限制性内切酶切割质粒，将四环素抗性盒插入folC序列，用DNA聚合酶l，大(Klenow)片段(ThermoFisher)平末端，使用FastAP去磷酸化并使用T4DNA连接酶(ThermoFisher)连接。[0257] 此外，来自罗伊氏乳杆菌(folC2?LR)(SEQIDNO:22)和来自棉阿舒囊霉(folC2?AG)(SEQIDNO:23)的异源folC2蛋白序列用于设计用于folC2?LR(罗伊氏乳杆菌)(SEQIDNO:24)和folC2?AG(棉阿舒囊霉)(SEQIDNO:25)异源基因表达的密码子优化DNA序列。合成DNA片段(IDT集成DNA技术公司)并用于构建两个整合盒(如图5所示)。首先，我们使用DNA聚合酶l、大(Klenow)片段(ThermoFisher)生成了一个包含Pveg启动子(SEQIDNO:37)的平末端片段，并将其连接到具有folC同源性的质粒中，之前用Xbal切割并用DNA聚合酶l平端，大(Klenow)片段(ThermoFisher)平末端。[0258] 接下来，用Bcul和FspA1限制性内切酶切割新构建的质粒并使用FastAP去磷酸化。之后，将质粒与folC2?LR中的有序优化序列folC2?AG连接，之前用Bcul和FspA1限制酶切割。在该四环素抗性质粒中，在用FspA1限制质粒并去磷酸化后，将先前用EcoRI限制酶切割并平端的质粒连接起来。构建的质粒用作PCR引物SEQIDNO：43和SEQIDNO：44的模板，以产生用于转化的folC干扰/替换盒。[0259] 实施例5用于转化的叶酸操纵子构建体的组装[0260] 在组装叶酸操纵子(参见实施例3)后，具有叶酸生物合成基因的DNA片段进一步用Xbal限制酶切割，并用引物SEQIDNO:40和SEQIDNO:41(62℃,40s)与红霉素抗性盒(SEQIDNO:58)的合成DNA片段连接，并用XbaI切割以确保兼容的DNA末端用于连接。连接后，用引物(SEQIDNO：36和SEQIDNO：39)对整个片段进行PCR扩增。[0261] 在组装的最后一步中，添加了具有lacA同源性和调节启动子区域的片段(SEQIDNO：18)。用Spel限制酶切割片段并用于连接。将连接混合物用作具有引物(SEQIDNO:42和SEQIDNO:39)的PCR模板，我们用它完成人工叶酸操纵子(如图4所示)的组装作为表达盒(SEQIDNO:20)用于将基因组转化进枯草芽孢杆菌菌株。[0262] 实施例6：选择可能的枯草芽孢杆菌宿主菌株用于工程化叶酸生产[0263] 不同的芽孢杆菌菌株可用作叶酸生产工程的出发菌株(表3)。芽孢杆菌菌株可以从自然界分离或从培养物保藏中心获得。其中，可以从枯草芽孢杆菌菌株中选择用于叶酸生产的出发菌株，这些菌株已经经历了经典的诱变和选择方法，以过量生产与嘌呤生物合成途径相关的代谢物。例如，可以选择过度生产核黄素、肌苷和鸟苷的菌株。优选经过嘌呤和核黄素途径的随机诱变和毒性代谢抑制剂的菌株，并包含在表3中。[0264] 表3.可用于开发叶酸生产的潜在非转基因枯草芽孢杆菌出发菌株。[0265][0266][0267] VKPMB2116菌株是枯草芽孢杆菌168菌株(最常见的枯草芽孢杆菌宿主菌株，基因组约为4Mbp)的杂交菌株，具有来自枯草芽孢杆菌W23菌株的6.4kbpDNA岛。这种结构对于大多数枯草芽孢杆菌工业菌株很常见，是通过用W23(原养型TrpC+)DNA转化168菌株(色氨酸营养缺陷型trpC?)而获得的。它在基因组中有一个6.4kbp的W23岛，与常用的枯草芽孢杆菌SMY菌株相同，它是具有公开可用基因组的枯草芽孢杆菌遗留菌株之一(Ziegler等人，168的起源,W23和其他枯草芽孢杆菌遗留菌株，细菌学杂志，2008,21,6983–6995)。VKPMB2116菌株是SMY菌株的直系后代，通过经典诱变和选择获得。该菌株的另一个名称是枯草芽孢杆菌VNIIGenetika304。该菌株的构建描述在1980年提交的苏联专利SU908092中。通过随后的诱变和代谢抑制剂的选择获得突变。菌株VKPMB2116对玫瑰黄色素(一种维生素B2的有毒类似物)具有抗性，这是由于编码黄素激酶的ribC基因发生突变。该菌株还对8?氮鸟嘌呤(嘌呤碱基的毒性类似物)具有抗性。[0268] 实施例7：替换folC并产生用于叶酸生产的最佳宿主菌株[0269] 在构建异源folC2(folC2?AG或folC2?LR)基因表达盒后(参见实施例4和图5)，我们进行了枯草芽孢杆菌VBB38和枯草芽孢杆菌VBB38Δrib的转化。用引物SEQIDNO：43和SEQIDNO：44通过PCR扩增具有天然folC基因破坏同源性的表达盒。转化后，选择对四环素有抗性的菌落，用异源folC2基因(A.gossypii或L.reuteri)替换天然folC基因，用cPCR和获得的PCR产物的测序进行遗传确认。新菌株用于检测总叶酸的产量(参见图18)，并比较上清液和细胞生物量之间的总叶酸分布。[0270] 实施例8：枯草芽孢杆菌的转化[0271] i)枯草芽孢杆菌天然能力转化[0272] 从新鲜的枯草芽孢杆菌平板中接种10mLSpC培养基并培养过夜。将1.3mL的过夜培养物稀释到10mL的新鲜SpC培养基中(9倍稀释)。OD450经测量，预计在0.5左右。培养物在37℃220RPM下生长3小时10分钟。再次测量OD450，预计在1.2?1.6之间。用SpII(饥饿培养基)按1:1稀释培养物。将3.5ml培养物与3.5ml饥饿培养基混合，并添加浓度为50ug/ml的色氨酸。培养物在37℃、220RPM下再生长2小时。孵育后培养物最多可容纳1小时。在2mL微量离心管中将500μl感受态细胞与DNA(5?20μl，取决于浓度)混合，并在37℃下摇动孵育30分钟。加入300μl新鲜LB以回收感受态细胞，并在37℃下再孵育30分钟。微量离心管以3000RPM离心5分钟。将颗粒重悬并铺在具有适当抗生素的LB板上。[0273] 培养基：[0274] 基于10xT[0275] 150mM硫酸铵[0276] 800mMK2HPO4[0277] 440mMKH2PO4[0278] 35mM柠檬酸钠[0279] SpC(最小培养基)[0280] 基于100mL1xT[0281] 1mL50％葡萄糖[0282] 1.5mL1.2％MgSO4[0283] 2mL10％酵母提取物[0284] 2.5mL1％酪蛋白氨基酸[0285] SpII(饥饿培养基)[0286] 基于100ml1xT[0287] 1ml50％葡萄糖[0288] 7ml1.2％MgSO4[0289] 1ml10％酵母提取物[0290] 1ml1％酪蛋白氨基酸[0291] 0.5ml100mMCaCl2[0292] 实施例10：使用qPCR测定叶酸操纵子拷贝数[0293] 我们使用实时定量PCR(qPCR)技术来确定整合的枯草芽孢杆菌人工叶酸操纵子基因的拷贝数。产生叶酸的枯草芽孢杆菌转化体中人工叶酸操纵子中基因folP、folK、folE、dfrA和KnR(卡那霉素抗性基因)的拷贝数通过(qPCR)和SYBRGreenI检测进行估计。通过qPCR对人工枯草芽孢杆菌叶酸操纵子上卡那霉素抗性基因(KnR)的拷贝数和叶酸生物合成基因folP、folK、folE、dfrA的拷贝数进行定量。用SWWizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega)分离枯草芽孢杆菌菌株的基因组DNA。在OD260和OD280分光光度法评估gDNA的浓度和纯度。所有实验中使用的gDNA量等于参考菌株的gDNA量。使用含有基因folP、folK、folE、dfrA和KnR的人工叶酸操纵子的单拷贝的枯草芽孢杆菌作为基因拷贝数相对定量的参考菌株。管家基因DxS是枯草芽孢杆菌基因组中的单拷贝基因，被用作内源性对照基因。叶酸生物合成基因的基因拷贝数的定量使用特定的引物组进行(引物对SEQIDNO:59和SEQIDNO:60用于folP基因，引物对SEQIDNO:61和SEQIDNO:62用于folK基因，引物对SEQIDNO:63和SEQIDNO:64用于folE基因，引物对SEQIDNO:65和SEQIDNO:66用于dfrA基因)，用于定量连接到叶酸操纵子的卡那霉素抗性标记物(引物对SEQIDNO:67和TMSEQIDNO:68)，使用参考DxS基因引物对SEQIDNO：71和SEQIDNO：72。在StepOne 实时2?ΔΔCT荧光定量PCR系统上进行qPCR分析，并使用 方法进行定量。[0294] 人工BS?FOL?OP菌株中基因的基因拷贝数相对于具有一个基因拷贝的菌株进行量化。以具有一个拷贝数的枯草芽孢杆菌菌株的KnR基因作为参考菌株，对枯草芽孢杆菌转化菌株中人工叶酸操纵子中基因的基因拷贝数进行相对定量。与具有单拷贝基因的枯草芽孢杆菌菌株相比，基因folP、folK、folE、dfrA和KnR基因的qPCR相对定量显示RQ值增加了6倍。叶酸高产菌株FL179和FL722被证实具有叶酸合成操纵子的多拷贝整合。[0295] 实施例11:枯草芽孢杆菌菌株的培养[0296] 制备来自冷冻的冷冻管的系列稀释液，并用适当的抗生素铺到MB板上，并在37℃下孵育约48小时。为了进一步测试，每个菌株使用来自MB板的至少10?20个单菌落。首先在新鲜的MB板上(使用相同浓度的抗生素)重新修补10?20个单菌落进行测试。[0297] 对于营养阶段，使用MC培养基，每个离心管用1个塞子接种(或每个带挡板的锥形烧瓶5个塞子或用于微量滴定板的一小部分贴片)。培养基中加入适当的抗生素。对于微量滴定板，在96深孔中使用500μl培养基，对于离心管，使用5ml培养基(在50ml离心管中)，对于锥形烧瓶，使用25ml(在250ml烧瓶中)。培养物在37℃以220RPM孵育18?20小时。[0298] 接种到生产培养基(MD)是在营养培养基中18?20小时后。使用10％的接种物(MW为50μl，离心管为0.5ml，锥形烧瓶为2.5ml)。每个菌株在两个等分试样中进行测试。对于微量滴定板，在48深孔中使用500μl培养基，对于离心管，使用5ml培养基，对于带挡板的锥形烧瓶，使用25ml。金属丝用于离心管中以更好地通气，就像用纱布代替锥形烧瓶上的塞子一样。将培养物在37℃以220RPM孵育48小时。根据开发的程序，使用微生物测定法测量24和48小时后的总叶酸滴度。[0299] 最好的候选菌株以相同的方式重新测试，并在多次确认后准备在生物反应器中测试。将用于生物反应器测试的选定菌株的100μl冷冻培养物铺展到带有适当抗生素的MB板上，并在37℃下孵育约48小时。用每板2ml无菌20％甘油收集完整的生物质。收集的生物质被分配到100μl等分试样中并在?80℃下冷冻。这被用作生物反应器测试的工作细胞库。[0300] 培养基成分：[0301] 1)MB(板)[0302] 胰蛋白胨10g/l[0303] 酵母提取物5g/l[0304] NaCl5g/l[0305] 麦芽糖20g/l[0306] 琼脂20g/l[0307] pH7.2?7.4[0308] 高压蒸汽处理30分钟，121℃[0309] 高压蒸汽处理和冷却后加入适当的抗生素。[0310] 2)MC(营养培养基)[0311] 糖蜜20g/l[0312] CSL20g/l[0313] 酵母提取物5g/l[0314] MgSO4*7H2O0.5g/l[0315] (NH4)2SO45g/l[0316] 将成分混合在一起并将pH设置为7.2?7.4。然后加入KH2PO4?K2HPO4溶液，最终浓度为KH2PO41.5g/l和K2HPO43.5g/l。将培养基分配到离心管(5ml/50ml?离心管)或锥形烧瓶(25ml/250ml?带挡板的锥形烧瓶)中，并在121℃下高压蒸汽处理30分钟。高压蒸汽处理后添加无菌葡萄糖，最终浓度为7.5g/l。在接种前添加抗生素。[0317] 3)MD(生产培养基)[0318] 酵母20g/l[0319] 玉米浆(CSL)5g/l[0320] MgSO4*7H2O0.5g/l[0321] 对氨基苯甲酸(pABA)0.5g/L[0322] 将成分混合在一起并将pH设置为7.2?7.4。然后加入KH2PO4?K2HPO4溶液，最终浓度为KH2PO41.5g/l和K2HPO43.5g/l。培养基在121℃高压蒸汽处理30分钟。无菌尿素溶液(20ml原液，终浓度为6g/L)，无菌葡萄糖溶液(250ml原液，终浓度为100g/L葡萄糖)，无菌pABA溶液(100ml原液，终浓度为0.5g/L)，高压蒸汽处理后加入150ml无菌水，得到1LMD+pABA500培养基。接种前加入适当的抗生素。然后将培养基分配到无菌锥形烧瓶中(25ml/250ml?带挡板的锥形烧瓶。[0323] 实施例12:定量发酵液中总叶酸的微生物测定[0324] 使用海氏肠球菌NRRLB?1295的微生物测定法用于检测枯草芽孢杆菌菌株中产生的总叶酸。微生物测定用于评估枯草芽孢杆菌产生的细胞内(保留在生物质中)和细胞外(释放到培养基中)的总叶酸。对于微生物测定，使用指示生物海氏肠球菌NRRLB?1295，它对叶酸具有营养缺陷型。E.hirae在富含叶酸(乳酸杆菌AOAC肉汤)的生长培养基中在37℃预培养18?24小时。然后在不含叶酸的生长培养基(叶酸测定培养基)中洗涤以去除残留的叶酸。将洗涤过的E.hirae培养物接种到不含叶酸的测定培养基中。微生物测定在96孔微量滴定板中进行。将适当稀释的待测培养基样品和叶酸标准溶液添加到含有指示菌株的生长培养基中，并将板在37℃下孵育20小时。指示生物的生长反应与培养基样品/对照中存在的叶酸的量成正比。通过将一组叶酸标准溶液添加到生长培养基和指示菌株中，为每个测定构建标准曲线。通过测量600nm波长处的光密度(OD)来测量生长。E.hirae对测试样品的生长反应与已知标准溶液的生长反应进行定量比较。如上所述制备和测定含有不同浓度叶酸的稀释系列。通过在已知浓度的叶酸下绘制测量的OD600得到标准曲线。标准曲线用于计算测试样品中总叶酸的量。指示生物E.hiraeNRRLB?1295用于检测被测样品中0.05至0.7ng/mL范围内的总叶酸浓度。B.subtilis菌株产生的细胞外和细胞内总叶酸可以通过将适当稀释的测试样品添加到叶酸测定培养基中的指示生物E.hirae中来估计。[0325] 实施例13:不同出发菌株和初始folC替换和叶酸操纵子扩增菌株的总叶酸产量分析[0326] 其中folC基因被来自A.gossypii(枯草芽孢杆菌菌株FL21)或L.reuteri(枯草芽孢杆菌菌株FL23)的异源folC2基因替换的转化体和具有扩增的叶酸操纵子的转化体在摇床秤(5ml生产培养基MD)测试总叶酸量。发酵后，仔细收集发酵液样品(200μl)以获得均质样品，并在冰冷的提取缓冲液(0.1M磷酸盐缓冲液和1％(w/v)抗坏血酸)中稀释10倍。将样品在14,000rpm和4℃下离心10分钟并过滤灭菌(0.22μm孔径)。对于微生物测定，样品在提取缓冲液中连续稀释并保持在4℃，直到建立微生物测定。表4给出了通过微生物测定法测量的选定菌株的结果。[0327] 表4.摇床放大实验中不同枯草芽孢杆菌菌株的总叶酸产量(5ml)[0328][0329][0330] 实施例14：使用LC?MS测定叶酸形式和相关化合物的浓度并鉴定10?甲酰基?二氢叶酸和10?甲酰基叶酸作为两种主要产物[0331] 除了微生物分析，我们的目标是开发灵敏且通用的分析方法，具有相当短的分析运行时间。该方法必须是与挥发性流动相兼容的LCMS，还必须能够进行UV检测并尽可能多地对叶酸相关分析物进行良好的色谱分离。[0332] 仪器和材料：[0333] 该方法是在带有PDA检测器的ThermoAccela1250HPLC仪器上开发的，与支持MS/MS的质谱仪ThermoTSQQuantumAccessMAX相结合，配备hESI源。方法已在ThermoAcclaimRSLCPA2、150x2.1mmHPLC柱上设置，粒径为2.2μm。PDA检测器设置为282nm，带宽为9nm，扫描速率为80Hz，DAD扫描范围为200?800nm。柱温箱设置为60℃，托盘冷却(traycooling)设置为12℃。进样溶剂为10％甲醇水溶液，清洗和冲洗体积：2000μl。进样量设置为10μl，当需要更高浓度的分析物时，也可以设置为1μl。流动相A是650mM乙酸水溶液，流动相B是甲醇。流动相流速为0.5ml/min，总运行时间为20分钟。方法是使用表5中的梯度程序和表6中描述的MS光谱仪参数。[0334] 表5.色谱分析梯度程序[0335] 时间/分钟 ％A ％B0.00 100 02.00 100 016.00 82 1816.01 100 020.00 100 0[0336] 表6.质谱仪调谐参数(tuneparameter)和其他MS/MS相关参数[0337][0338][0339] LCMS检测器连接在DAD检测器之后，在400?600m/z模式下进行扫描，在SIM模式下在其M.W.+1和MS/MS模式下观察分析物(表6)。通过称重并溶解在0.1MNaOH溶液(表7和表8)中制备标准品，并立即放入HPLC仪器。[0340] 表7.可用标准[0341][0342] 表8.观察到的标准品及其相关的MS/MS方法设置[0343][0344][0345] 该方法对高达1000mg/L分析物的MS/MS检测具有线性响应，所有标准品的相关性均高于90％。[0346] 实施例15：通过转基因枯草芽孢杆菌生产不同比例的叶酸及其衍生物[0347] 其中folC基因被来自A.gossypii(枯草芽孢杆菌菌株FL21)或L.reuteri(枯草芽孢杆菌菌株FL23)的异源folC2基因替换的转化体和具有扩增的叶酸操纵子的转化体在摇床秤(5ml生产培养基MD)测试总叶酸量。[0348] 将菌株用适当的抗生素贴在MB板上，并在37℃下培养2天。对于摇瓶实验，将生长的菌株转移到Falcon50mL锥形离心管(1个塞子/5ml)中的5mlMC(种子)培养基中，并在旋转振荡器上以220RPM和37℃培养16–18小时。使用10％的种子培养物的接种物接种5mL生产培养基(MD+pABA500)。将菌株在旋转摇床上以220RPM和37℃在黑暗中培养48小时。发酵后，仔细收集发酵液样品(200μl)以获得均质样品，并在冰冷的提取缓冲液(0.1M磷酸盐缓冲液和1％(w/v)抗坏血酸)中稀释10倍。将样品在14,000rpm和4℃下离心10分钟并过滤灭菌(0.22μm孔径)。对于不同叶酸种类的定量，如实施例14中所述使用HPLC方法。不同枯草芽孢杆菌菌株的结果显示在表9中，发酵液样品的代表性HPLC色谱图显示在图13中。[0349] 表9.摇床放大实验中不同枯草芽孢杆菌菌株的总叶酸产量(5ml)[0350][0351][0352] 与野生型菌株枯草芽孢杆菌168相比，具有异源folC?AG和来自枯草芽孢杆菌的过表达叶酸生物合成基因的菌株FL179显示出43297％的10?甲酰基叶酸产量的增加。[0353] 实施例16：10?甲酰基二氢叶酸氧化转化为10?甲酰基叶酸[0354] 在发酵结束时，肉汤的HPLC分析检测到相对高量(85面积％)的10?甲酰基二氢叶酸(10F?DHF)。此外，我们观察到10?甲酰基二氢叶酸可以氧化转化为10?甲酰基叶酸(见图14)。因此，我们开始开发一种方案，该方案将提供10?甲酰叶酸的定量转化。我们预计随后的去甲酰化步骤将以尽可能高的产量提供叶酸。文献检索揭示了一份开云优惠体育网页版入口，描述了在特定pH值的水溶液中空气对四氢叶酸的氧化(Reed1980)。根据该开云优惠体育网页版入口，在pH值4、7和10时，主要的氧化产物是对氨基苯甲酰谷氨酸(PABG)和6?甲酰蝶呤。此外，仅在pH＝10时检测到7,8?二氢叶酸中间体。我们对发酵液上清液进行了一系列氧化实验，以促进10?甲酰基二氢叶酸快速转化为10?甲酰基叶酸。我们检查了几种氧化试剂，例如O2、H2O2和NaIO4(见图14)。[0355] 表10.pH对发酵液上清液中用氧气将10?甲酰基二氢叶酸氧化成10?甲酰基叶酸的影响[0356][0357] 使用10mL发酵液上清液在50mL圆底烧瓶中进行实验。pH值由1.0M和0.1MNaOH溶液设定。通过HPLC测量反应进程和结果。HPLC样品在提取缓冲液(含1％(w/v)抗坏血酸的0.1M磷酸盐缓冲液)中制备。将所有反应在环境温度(25℃)避光搅拌48小时。[0358] 使用1M和0.1MHCl或NaOH调节所需的pH值。较低pH值下的反应较慢并保持相对较高的叶酸总量(表10，条目2?4)。相反，在较高pH值下的反应(表10，条目5?7)提高了10?甲酰基二氢叶酸的消耗，尽管显着显著降低了叶酸的总量。我们预计我们可以使用替代试剂进行氧化，例如过氧化氢或高碘酸钠。[0359] 代表性实验程序：[0360] 将发酵肉汤以4,500rpm离心并慢慢倒出上清液。将10mL发酵液上清液移液到50mL圆底烧瓶中，该烧瓶配备有搅拌棒、pH计和用于避光的铝箔。滴加氢氧化钠或盐酸(1.0M和0.1M用于微调)以设定pH值并在环境温度(25℃)下剧烈搅拌反应24小时。用来自气球的空气吹扫反应混合物。搅拌48小时后，用9mL提取缓冲液(含1％(w/v)抗坏血酸的0.1M磷酸盐缓冲液)稀释1mL每种发酵液，重复两次实验。将悬浮液在涡旋上搅拌，以4,500rpm离心，通过0.22μm过滤器过滤并在HPLC上分析。[0361] 表11.过氧化氢浓度对发酵液上清液中10?甲酰基二氢叶酸氧化为10?甲酰基叶酸的影响[0362][0363] 使用10mL发酵液上清液在50mL圆底烧瓶中进行实验。过氧化氢以30％的水溶液形式逐滴加入。通过HPLC测量反应进程和结果。HPLC样品在提取缓冲液(含1％(w/v)抗坏血酸的0.1M磷酸盐缓冲液)中制备。将所有反应在环境温度(25℃)避光搅拌48小时。[0364] 以50?500mg/L的浓度范围添加过氧化氢，一种用于将10?甲酰基二氢叶酸氧化转化为10?甲酰基叶酸的替代氧化剂，从而提供更先进的结果(表11)。在反应的前24小时内，10?甲酰基二氢叶酸的浓度降至其初始值的50％。将反应延长至48小时提供了良好的转化率，从而保持了相对较高的总叶酸总量。[0365] 代表性实验程序：[0366] 将发酵肉汤以4,500rpm离心并慢慢倒出上清液。将10mL发酵液上清液移液到50mL圆底烧瓶中，该烧瓶配备有搅拌棒、pH计和用于避光的铝箔。将过氧化氢以30％的水溶液形式逐滴加入，并将反应混合物在环境温度(25℃)下剧烈搅拌24?48小时。搅拌48小时后，用9mL提取缓冲液(含1％(w/v)抗坏血酸的0.1M磷酸盐缓冲液)稀释1mL每种发酵液，重复试验两次。将悬浮液在涡旋上搅拌，以4,500rpm离心，通过0.22μm过滤器过滤并在HPLC上分析。[0367] 表12.高碘酸钠浓度对发酵液上清液中10?甲酰基二氢叶酸氧化为10?甲酰基叶酸的影响[0368][0369] 使用10mL发酵液上清液在50mL圆底烧瓶中进行实验。一次性加入高碘酸钠。通过HPLC测量反应进程和结果。HPLC样品在提取缓冲液(含1％(w/v)抗坏血酸的0.1M磷酸盐缓冲液)中制备。将所有反应在环境温度(25℃)避光搅拌48小时。[0370] 高碘酸钠经常被用作反复无常底物的首选试剂。我们对该试剂的初步实验表明，氧化转化的有效浓度在1?10g/L之间。以两种不同的浓度添加高碘酸钠，5g/L和10g/L。在反应的前24小时内，10?甲酰基二氢叶酸浓度较初始值显著下降(表12)。将反应延长至48小时提供了极好的转化率，从而保持了相对较高的总叶酸总量。[0371] 代表性实验程序：[0372] 将发酵肉汤以4,500rpm离心并慢慢倒出上清液。将10mL发酵液上清液移液到50mL圆底烧瓶中，该烧瓶配备有搅拌棒、pH计和用于避光的铝箔。一次性加入高碘酸钠并将反应混合物在环境温度(25℃)下剧烈搅拌24小时。搅拌48小时后，用9mL提取缓冲液(含1％(w/v)抗坏血酸的0.1M磷酸盐缓冲液)稀释1mL每种发酵液，重复实验2次。将悬浮液在涡旋上搅拌，以4,500rpm离心，通过0.22μm过滤器过滤并在HPLC上分析。[0373] 实施例18：在5L生物反应器体积中生产叶酸[0374] 在使用适当条件培养和生产叶酸的生物反应器中，叶酸的生产可以大大提高。该过程包括预培养物的制备和主要的补料分批生物工艺。[0375] i)预培养物的制备[0376] 用菌株FL179的工作细胞库接种烧瓶中的预培养基(FOL?MC，表13)，并在旋转摇床上以37℃和220RPM(2”抛)培养11?14小时。[0377] ii)分批补料生物工艺[0378] 叶酸的生产在5L生物反应器中使用FOL?ME培养基进行(表14)。生物反应器启动参数为搅拌＝600RPM，通气＝1vvm，使用氢氧化铵溶液将pH控制在7。用10％的预培养物接种生物反应器。DO由搅拌和气流控制，以保持空气饱和度在30％以上。当发酵液中的葡萄糖耗尽时，开始加入葡萄糖和CSL混合物(表15)。加料速度需要小心控制，加料速度控制在一个水平，不会导致乙偶姻(不超过10g/L)的积累。如果发酵液中未检测到乙偶姻，则加料速率过低。发酵液中的对氨基苯甲酸(PABA)浓度需要定期测量，并通过分批加入浓缩的PABA原液(50g/L)将其保持在500mg/L以上。生物工艺通常在50小时内完成。叶酸生产生物工艺概况如图17所示。[0379] 表13.FOL?MC预培养基[0380]组分 量糖蜜 20g/L玉米浆(CSL) 20g/L酵母 5g/L(NH4)2SO4 5g/LMgSO4x7H2O 0.5g/LKH2PO4 1.5g/LK2HPO4 3.5g/L葡萄糖 7.5g/L卡那霉素 10mg/L四环素 10mg/L[0381] 表14.FOL?ME生产培养基[0382][0383][0384] 表15.加料溶液(葡萄糖+CSL)[0385] 组分 量葡萄糖一水合物 400g/L玉米浆(CSL) 310g/L[0386] 实施例19:使用qPCR测定叶酸生物合成基因的表达水平[0387] 培养生长条件：枯草芽孢杆菌培养物在LB培养基中生长至指数期。将培养物与2倍体积的RNA保护细菌试剂(QIAGEN)混合，以4500rpm离心10分钟并在?80℃下冷冻或立即处理。将细胞沉淀重悬在200μL含有1mg/mL溶菌酶的TE缓冲液中15分钟，以去除细胞壁。根据制造商的方案，使用QIAGENRneasymini试剂盒分离RNA。用分光光度法检查获得的RNA的浓度和质量。用DNase(Ambion试剂盒)处理分离的RNA，并使用RevertAidHMinus第一链cDNA合成试剂盒(ThermoScientific)逆转录为cDNA。将获得的cDNA稀释，最终的cDNA产量为cca2.5ng/μL。[0388] 获得的cDNA通过qPCR分析(StepOne实时荧光定量PCR系统，AppliedBiosystems)和SYBRGreenI(ThermoScientific)检测进行分析。通过实时定量PCR(qPCR)技术对整合的枯草芽孢杆菌人工叶酸操纵子基因folP、folK、folE、dfrA中叶酸操纵子基因的表达进行定量。[0389] 内部对照基因用作定量qPCR表达数据标准化的参考，使用来自枯草芽孢杆菌的16SrRNA基因。叶酸生物合成基因的表达使用特定的引物组确定(引物对SEQIDNO:59和SEQIDNO:60用于folP基因，引物对SEQIDNO:61和SEQIDNO:62用于folK基因，引物对SEQIDNO:63和SEQIDNO:64用于folE基因，dfrA基因的引物对SEQIDNO:65和SEQIDNO:66)，对于选择作为内部对照的16S基因，使用引物对SEQIDNO：69和SEQIDNO：70。在TM ?ΔΔCTStepOne 实时荧光定量PCR系统上进行qPCR分析，并使用2 方法进行定量。[0390] 在两个单独的基因组位置(amyE和lacA)具有多拷贝合成叶酸操纵子的最佳叶酸生产菌株FL722被证实具有最强的叶酸生物合成基因表达水平。[0391] 实施例20:10?甲酰基叶酸向叶酸的化学转化[0392] 酸介导的去甲酰化[0393] 10?甲酰基叶酸的去甲酰化以0.01mmol规模(5mg)进行。在配备有搅拌棒的2mL微量离心管中称量10?甲酰基叶酸并悬浮在蒸馏水(1mL)中。用酸(50当量，0.5mmol)处理悬浮液并在环境温度下搅拌16小时。随后，用DMSO(800μL)稀释悬浮液(200μL)，在涡流搅拌器上均质化并在HPLC上分析。去甲酰化的结果示于表16。[0394] 表16.不同酸对10?甲酰叶酸的N?去甲酰化的影响[0395][0396] 所有实验均在2mL微量离心管中使用10?甲酰叶酸(5mg，0.01mmol)进行。a转化率b通过HPLC测量。n.d.?没有检测到。由于分析物可能吸附到Dowex50WX2树脂上，因此在该c d实验中既没有检测到10?甲酰基叶酸也没有检测到叶酸。TFA?三氟乙酸。TCA——三氯乙e酸。PTSA–对甲苯磺酸。[0397] 10?甲酰基叶酸与强无机酸的去甲酰化几乎定量地进行到叶酸(表16，条目1和8)。或者，用更强的有机酸进行去甲酰基化可以提供几乎相同效率的叶酸(表16，条目3,4和6)。正如预期的那样，用甲酸和乙酸去甲酰化没有提供转化(表16，条目5和7)。使用Dowex50WX2树脂对去甲酰化的HPLC分析未提供对起始材料或产物的检测，因为分析物可能仍吸附在树脂上并需要洗脱。[0398] 发酵液中10?甲酰叶酸的酸介导N?去甲酰化[0399] 在之前的实验中，我们已经说明，使用强酸对10?甲酰基叶酸标准品进行去甲酰化可以完全转化为叶酸，如图15所示。在这里，我们将相同的原理应用于更复杂的系统，即发酵液。为了继续对生物样品进行实验，我们选择了盐酸(HCl)作为去甲酰化试剂，因为它比我们研究的其他酸高效且便宜。来自实施例18的发酵液的HPLC分析显示在生物合成过程中形成的其他叶酸中大量的10?甲酰基叶酸(10?甲酰基叶酸46％面积；5?亚氨基甲基四氢叶酸47％面积和5?甲基四氢叶酸7％面积)。发酵液样品用1MHCl处理至不同的pH水平(pH＝4、3、2、1和0)，并在避光环境温度(25℃)下搅拌24小时。根据我们的HPLC分析，只有在较低的pH值(pH＝1和0)下，去甲酰化才提供适量的叶酸。基于这些结果，我们相信酸介导的去甲酰化策略可能适用于叶酸的下游加工。为了在复杂系统(例如发酵液)中开发具有成本效益的甲酰叶酸种类的去甲酰化方案，进一步优化酸量和反应温度是必不可少的。[0400] 将来自实施例18的充分搅拌的发酵液移液到六个配备有搅拌棒和pH电极的100mL圆底烧瓶中。在搅拌下滴加盐酸以达到如表17中所述的几个pH值(pH＝4、3、2、1、0)。[0401] 表17.发酵液3101的酸介导去甲酰化[0402] exp VFB VHCl VTotal pH1 50mL 0.0mL 50mL 7.02 50mL 10.2mL 60.2mL 4.03 50mL 15.6mL 65.6mL 3.04 50mL 21.4mL 71.4mL 2.05 50mL 35.3mL 85.3mL 1.06 50mL 59.0mL 109.3mL 0.0[0403] 通过将烧瓶包裹在铝箔中，将发酵混合物在环境温度(25℃)下搅拌24小时，以屏蔽UV光。尽管没有酸(实验1)，但在精确条件下制备了受控样品。搅拌24小时后，用9mL提取缓冲液(含1％(w/v)抗坏血酸的0.1M磷酸盐缓冲液)稀释1mL每种发酵液，重复试验2次。将悬浮液涡旋搅拌，以4500rpm离心，通过0.22μm过滤器过滤并在HPLC上分析。表18总结了HPLC结果。根据我们的HPLC分析，只有在较低的pH水平(pH＝1和0)下，去甲酰化提供了适量的叶酸。总之，我们开发了一种酸介导的10?甲酰基叶酸的去甲酰化，它是发酵的主要产物。[0404] 表18.来自实施例18的发酵液上酸介导的去甲酰化的基于HPLC的结果[0405] exp pH 5?FTHFmg/L 10?FFAmg/L FSUMmg/L FAmg/L1 7.0 432 487 919 02 4.0 171 567 738 03 3.0 97 632 729 04 2.0 76 529 605 05 1.0 54 326 549 1696 0.0 37 116 402 249[0406] 碱基介导的去甲酰化[0407] 浏览化学文献，我们发现了一些开云优惠体育网页版入口，这些开云优惠体育网页版入口描述了叶酸在更高的pH值下表现出更大的稳定性。在这样的pH值下，叶酸表现出更高的溶解度，这简化了合成操作、纯化和下游加工。因此，在使用0.1MNaOH的一系列N?去甲酰化实验中，我们的目标是从10?甲酰基叶酸清洁高效地转化为叶酸(参见图16)，这将简化目标产物从发酵液中的分离。使用0.01mmol规模(5mg)对10?甲酰基叶酸的分析标准品进行初步去甲酰化实验。[0408] 代表性实验程序：[0409] 在配备有搅拌棒和橡胶隔片的10mL圆底烧瓶中称量10?甲酰基叶酸。用0.1M氢氧化钠(50当量，0.5mmol，5mL)处理悬浮液，并在避光环境温度下搅拌24?48小时。随后，用叶酸提取缓冲液(900μL)稀释溶液(100μL)，在涡流搅拌器上均质化并在HPLC上分析。在HPLC上对三个时间相关的等分试样进行取样分析。去甲酰化结果列于表19。在24小时后的第一次取样期间，用0.1MNaOH将10?甲酰基叶酸去甲酰化几乎定量地生成叶酸(表19，条目1)。搅拌48小时后，根据HPLC分析，反应进行至完成。在相同条件下长时间搅拌表明，新形成的叶酸即使在144小时(6天)后也没有分解。[0410] 表19.在0.1MNaOH存在下10?甲酰基叶酸的N?去甲酰基化为叶酸的时间尺度[0411][0412] 使用10?甲酰基叶酸(5mg,0.01mmol)在10mL圆底烧瓶中进行实验。加入过量的0.1MNaOH，50.0当量，5mL。实验开始时，10?FFA的质量浓度约为1000mg/L。通过HPLC测量反应进程。HPLC样品在提取缓冲液(含1％(w/v)抗坏血酸的0.1M磷酸盐缓冲液)中制备。[0413] 发酵液中10?甲酰叶酸的碱介导N?去甲酰化[0414] 在之前的实验中，我们已经说明，使用0.1MNaOH对10?甲酰基叶酸标准品进行去甲酰化可以完全转化为叶酸，如图16所示。在这里，我们将相同的原理应用于更复杂的系统，即发酵液。在去甲酰基化之前对来自实施例18的发酵液的HPLC分析显示大量的10?甲酰基二氢叶酸(10F?DHF；60％面积)；和10?甲酰叶酸(10F?FA；40％面积)。用不同v/v比的0.1MNaOH(1:1、1:2、1:3和1:4)处理来自实施例18的发酵液样品(10mL)，并在避光环境温度(25℃)下搅拌24小时。根据我们的HPLC分析，发酵液/NaOHv/v1:1和1:2的实验不会导致去甲酰化，而是导致10?甲酰基二氢叶酸氧化转化为10?甲酰基叶酸，如表20所示(条目2和3)。随后，当相对于发酵液(1:3和1:4)增加NaOH的量时，通过HPLC检测到显著量的叶酸，如表20所示(条目4和5)。有趣的是，较高量的NaOH在某种程度上阻碍了10F?DHF向10F?FA的氧化转化，因为通过HPLC检测到大量的10F?DHF。[0415] 代表性实验程序：[0416] 将来自实施例18的充分搅拌的发酵液(10mL)移液到配备有搅拌棒和铝箔用于避光的50?100mL圆底烧瓶中。逐滴加入氢氧化钠(0.1M)并将反应在环境温度(25℃)下剧烈搅拌24小时。搅拌24小时后，用9mL提取缓冲液(含1％(w/v)抗坏血酸的0.1M磷酸盐缓冲液)稀释1mL每种发酵液，重复试验2次。将悬浮液涡旋搅拌，以4500rpm离心，通过0.22μm过滤器过滤并在HPLC上分析。[0417] 表20.添加不同量NaOH对发酵液中10?甲酰叶酸的N?去甲酰化的影响[0418][0419] 使用来自实施例18的发酵液(FB3148，10mL)在50?100mL圆底烧瓶中进行实验。基于相对于FB3148(1:1、1:2、1:3和1:4)的体积/体积比添加0.1MNaOH。通过HPLC测量反应进程和结果。HPLC样品在提取缓冲液(含1％(w/v)抗坏血酸的0.1M磷酸盐缓冲液)中制备。将所有反应在环境温度(25℃)避光搅拌24小时。[0420] 实施例21:10?甲酰基叶酸的分离[0421] 收获后，使用5MNaOH水溶液将含有50g叶酸的发酵液调节至pH＝12。将溶液在4℃下以10000rpm离心15分钟。向上清液中加入50g氢氧化钙并在室温下搅拌悬浮液2小时。使所得悬浮液沉降、倾析并在100μl硅藻土(Celite)的帮助下过滤上清液。滤饼用500mL水洗涤并过滤。合并滤液并稀释至最终体积为10升。用1NHCl将澄清的叶酸稀碱溶液的pH值调节至7.0，加热至70℃，然后冷却至室温。接下来，过滤溶液以去除在中性pH下沉淀的杂质。使用1NHCl将澄清的滤液调节至pH＝3并在冰上冷却4小时。将悬浮液滤出并重新溶解在8LpH＝12的热碱性溶液中(用1MNaOH调节)。向该溶液中加入50克活性炭(1当量/重量的叶酸)并将溶液加热至50℃并搅拌30分钟。过滤悬浮液，滤饼用3L碱化水溶液(pH＝12，用NaOH调节)洗涤。合并滤液并使用1NHCl将pH调节至3.0，在连续搅拌期间添加。将所得浆液在冰上冷却24小时或过夜。滤出悬浮液并重新悬浮在1LpH＝3的酸化水溶液中(pH用1NHCl调节)。再次过滤悬浮液，然后将所得滤饼冷冻并干燥以获得43克叶酸，其含有10％的水分，并在无水基础上测定90.1％的叶酸。[0422] 实施例22叶酸的分离[0423] 收获后，使用1MNaOH水溶液将含有30g叶酸的发酵液调节至pH＝10。将溶液在4℃下以10000rpm离心15分钟。将所得上清液用1NHCl调节至pH4.0，加热至70℃，然后冷却至室温。接着，借助100g硅藻土(Celite)过滤溶液。将滤饼重新悬浮在5LpH＝10的碱性溶液中(用1MNaOH调节)。向该溶液中加入50克活性炭(1当量/重量的叶酸)并将溶液加热至50℃并搅拌30分钟。过滤悬浮液，滤饼用2L碱化水溶液(pH＝12，用NaOH调节)洗涤。合并滤液并使用1NHCl将pH调节至3.0，在连续搅拌期间添加。将所得沉淀在冰上冷却16?24小时或然后滤出并重新悬浮在1L具有pH＝3的酸化水溶液中(pH用1NHCl调节)。再次过滤悬浮液并将所得沉淀饼干燥以获得21克10?甲酰基叶酸，测定其含量为92％。[0424] 比较例1[0425] 确定枯草芽孢杆菌野生型菌株“168”、我们的出发非转基因菌株VBB38(菌株VKPMB2116＝B.subtilisVNIIGenetika304)及其转化体的总叶酸产量，其中天然folC基因一步替换为来自A.gossypii(B.subtilis菌株FL21)或L.reuteri(B.subtilis菌株FL23)的异源folC2(FOL3)基因。在摇床规模(5ml生产培养基MD)下测试菌株，并通过使用用于叶酸检测的标准微生物测定法来测定总叶酸。[0426] 结果表明，在标准培养条件下(T＝37C，在营养丰富的LB培养基中需氧)，仅缺失枯草芽孢杆菌天然folC基因而没有同时表达异源folC2基因的敲除突变体不能生长。[0427] 文献：[0428] 1.HjortmoS,PatringJ,AndlidT.2008生长速度和培养基成分强烈影响酿酒酵母中的叶酸含量.IntJFoodMicrobiol.123(1?2):93?100.[0429] 2.McGuireJJandBertinoJR.1981.叶酰聚谷氨酸的酶促合成及其功能.MolCellBiochem38SpecNo(Pt1):19?48.[0430] 3.Reed,LS,ArcherMC.1980.空气氧化四氢叶酸.JAgricFoodChem.28(4):801?805.[0431] 4.Rossi,M.,Raimondi,S.,Costantino,L.,Amaretti,A.,2016.叶酸：化学和微生物生产的相关性。维生素、生物色素和抗氧化剂的工业生物技术.Wiley?VCHVerlagGmbH&Co.KGaA,Weinheim,Germany,pp.103–128.[0432] 5.ScaglioneandPanzavolta.2014.叶酸和5?甲基四氢叶酸不是一回事.Xenobiotica.44(5):480?488.[0433] 6.Serrano?AmatriainC,Ledesma?AmaroR,López?NicolásR,RosG,JiménezA,RevueltaJL.2016.通过工程化的Ashbyagossypii生产叶酸.MetabEng.38:473?482.[0434] 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专利地区：内蒙古

专利申请日期：2020-05-13

专利公开日期：2024-05-28

专利公告号：CN114286858B