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专利名称：一种维生素K1滴剂有关物质的测定方法

专利类型：实用新型专利

专利申请号：CN202210421653.1

专利申请（专利权）人：广西铭磊维生制药有限公司
权利人地址：广西壮族自治区来宾市华侨区圣堂路419号(高新技术产业开发区)11号、16号标准厂房

专利发明（设计）人：庞萍,李玉娜,黄德馨,莫伟

专利摘要：本发明公开了一种维生素K1滴剂有关物质的测定方法，采用高效液相色谱法测定，其色谱条件为：色谱柱：硅胶填充柱；流动相：以体积比为1000∶1?3∶0.1?0.5的正己烷?正辛醇?甲基叔丁基醚溶液为流动相A，以体积比为92?100∶2?5的正己烷?正辛醇溶液为流动相B；采用梯度洗脱方式；检测波长：240?260nm；流速为0.6～1.5毫升/分。本发明的能够准确有效的测定现有技术难以分离的维生素K1顺式异构体和维生素K1反式异构体。

主权利要求：一种维生素K1滴剂有关物质的测定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及色谱分析技术领域，具体涉及一种维生素K1滴剂有关物质的测定方法。
背景技术
[0002] 维生素K1化学名为2?甲基?3?叶绿基?1,4?萘醌，简称叶绿醌，是顺式和反式异构体的混合物。《中国药典》2020年版二部中规定，维生素K1原料药中顺式异构体按面积归一化法来计算不得过21.0％。说明该原料药中，真正其作用的为反式异构体，而顺式异构体是作为杂质来控制其含量的。该药典方法采用石油醚?正戊醇(2000:2.5)作为流动相，利用硅胶色谱柱作为分离通道，其方法重现性差，如果实验条件掌握不好就会导致两个异构体分离度达不到要求。而且该实验方法仅仅能控制顺式异构体，并不能有效的检测出杂质C和其他未知杂质。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种维生素K1滴剂有关物质的测定方法，能够准确有效的测定现有技术难以分离的维生素K1顺式异构体和维生素K1反式异构体。
[0004] 所述的维生素K1滴剂有关物质的测定方法，采用高效液相色谱法测定，其色谱条件为：
[0005] 色谱柱：硅胶填充柱；
[0006] 流动相：以体积比为1000∶1?3∶0.1?0.5的正己烷?正辛醇?甲基叔丁基醚溶液为流动相A，以体积比为92?100∶2?5的正己烷?正辛醇溶液为流动相B；采用梯度洗脱方式；
[0007] 检测波长：240?260nm；
[0008] 流速为0.6～1.5毫升/分。
[0009] 优选的，所述的梯度洗脱的方式为：
[0010]
[0011] 优选的，所述的色谱条件为：
[0012] 流动相：以体积比为1000∶1.4∶0.2的正己烷?正辛醇?甲基叔丁基醚溶液为流动相A，以体积比为96∶4的正己烷?正辛醇溶液为流动相B；
[0013] 检测波长：254nm；
[0014] 流速为0.6～1.5毫升/分。
[0015] 优选的，所述的色谱条件中，检测器采用二极管阵列检测器。
[0016] 优选的，所述的高效液相测定时，检测时间为45?120分钟。
[0017] 优选的，所述的高效液相测定时，柱温控制在25?40℃。
[0018] 优选的，所述的色谱柱为100?5?silica，250mm×4.6mm。
[0019] 所述的高效液相测定时，供试品溶液的制备包括以下步骤：
[0020] 取维生素K1滴剂胶囊10粒，将内容物倾入100ml量瓶中，囊壳用正己烷分次洗涤，洗液并入量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀。
[0021] 所述的高效液相测定时，对照品溶液的制备包括以下步骤：
[0022] 对照品溶液制备：取维生素K1对照品适量，精密称定，加正己烷溶解制备成浓度为1.0mg/ml的维生素K1标准储备液，然后用体积比为1∶9的中链甘油三酸酯?正己烷溶液定量稀释配制配制成0.05μg/mL的对照品溶液。

[0023] 本发明的有益效果如下：
[0024] 本发明采用了独特组成的流动相A和流动相B组合进行梯度洗脱，使得两个异构体得到很好的分离，并且能有效的检出杂质C和其他未知杂质，为该产品的质量可靠性、稳定性和安全行提供了保障与技术支持。
附图说明
[0025] 图1为维生素K1顺式异构体定位图
[0026] 图2有关物质系统适用性图谱
[0027] 图3为维生素K1滴剂(胶囊型)有关物质线性回归图
[0028] 图4为对照品溶液色谱图
[0029] 图5为本发明有关物质供试品溶液色谱图
[0030] 图6药典方法色谱图
[0031] 图7本发明有关物质供试品溶液色谱图
具体实施方式
[0032] 实施例1
[0033] 1、供试品溶液的制备：
[0034] 取维生素K1滴剂胶囊10粒，将内容物倾入100ml量瓶中，囊壳用正己烷分次洗涤，洗液并入量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀。
[0035] 维生素K1对照品溶液的制备：
[0036] 2、对照品溶液制备：取维生素K1对照品适量，精密称定，加正己烷溶解制备成浓度为1.0mg/ml的维生素K1标准储备液，然后用体积比为1∶9的中链甘油三酸酯?正己烷溶液定量稀释配制配制成0.05μg/mL的对照品溶液。
[0037] 3、采用高效液相色谱法进行测定，进样量为80μl，高效液相色谱法的色谱条件为：
[0038] 色谱柱：100?5?silica，250mm×4.6mm；
[0039] 流动相：以体积比为1000∶1∶0.1的正己烷?正辛醇?甲基叔丁基醚溶液为流动相A，以体积比为92∶2的正己烷?正辛醇溶液为流动相B；采用梯度洗脱方式；
[0040] 检测波长：240nm；
[0041] 流速为0.6毫升/分；
[0042] 检测器：采用二极管阵列检测器。
[0043] 检测时间：120分钟。
[0044] 柱温：25℃；
[0045] 梯度洗脱的方式为：
[0046]
[0047] 实施例2
[0048] 1、供试品溶液的制备：
[0049] 取维生素K1滴剂胶囊10粒，将内容物倾入100ml量瓶中，囊壳用正己烷分次洗涤，洗液并入量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀。
[0050] 2、维生素K1对照品溶液制备：取维生素K1对照品适量，精密称定，加正己烷溶解制备成浓度为1.0mg/ml的维生素K1标准储备液，然后用体积比为1∶9的中链甘油三酸酯?正己烷溶液定量稀释配制配制成0.05μg/mL的对照品溶液。
[0051] 3、采用高效液相色谱法进行测定，进样量为80μl，高效液相色谱法的色谱条件为：
[0052] 色谱柱：100?5?silica，250mm×4.6mm；
[0053] 流动相：以体积比为1000∶3∶0.5的正己烷?正辛醇?甲基叔丁基醚溶液为流动相A，以体积比为100∶5的正己烷?正辛醇溶液为流动相B；采用梯度洗脱方式；
[0054] 检测波长：260nm；
[0055] 流速为0.6～1.5毫升/分；
[0056] 检测器：二极管阵列检测器。
[0057] 检测时间：45分钟。
[0058] 柱温：40℃；
[0059] 梯度洗脱的方式为：
[0060]
[0061] 实施例3
[0062] 1、供试品溶液的制备：
[0063] 取维生素K1滴剂胶囊10粒，将内容物倾入100ml量瓶中，囊壳用正己烷分次洗涤，洗液并入量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀。
[0064] 2、维生素K1对照品溶液制备：取维生素K1对照品适量，精密称定，加正己烷溶解制备成浓度为1.0mg/ml的维生素K1标准储备液，然后用体积比为1∶9的中链甘油三酸酯?正己烷溶液定量稀释配制配制成0.05μg/mL的对照品溶液。
[0065] 3、采用高效液相色谱法进行测定，进样量为80μl，高效液相色谱法的色谱条件为：
[0066] 色谱柱：100?5?silica，250mm×4.6mm；
[0067] 流动相：以体积比为1000∶2∶0.3的正己烷?正辛醇?甲基叔丁基醚溶液为流动相A，以体积比为96∶4的正己烷?正辛醇溶液为流动相B；采用梯度洗脱方式；
[0068] 检测波长：250nm；
[0069] 流速为1.2毫升/分；
[0070] 检测器：二极管阵列检测器。
[0071] 检测时间：80分钟。
[0072] 柱温：25?40℃；
[0073] 梯度洗脱的方式为：
[0074]
[0075]
[0076] 实施例4
[0077] 1、供试品溶液的制备：
[0078] 取批号200101的维生素K1滴剂胶囊10粒，将内容物倾入100ml量瓶中，囊壳用正己烷分次洗涤，洗液并入量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀。
[0079] 2、维生素K1对照品溶液制备：取维生素K1对照品适量，精密称定，加正己烷溶解制备成浓度为1.0mg/ml的维生素K1标准储备液，然后用体积比为1∶9的中链甘油三酸酯?正己烷溶液定量稀释配制配制成0.05μg/mL的对照品溶液。
[0080] 3、采用高效液相色谱法进行测定，进样量为80μl，高效液相色谱法的色谱条件为：
[0081] 色谱柱：100?5?silica，250mm×4.6mm；
[0082] 流动相：以体积比为1000∶1.4∶0.2的正己烷?正辛醇?甲基叔丁基醚溶液为流动相A，以体积比为96∶4的正己烷?正辛醇溶液为流动相B；采用梯度洗脱方式；
[0083] 检测波长：254nm；
[0084] 流速为1毫升/分；
[0085] 检测器：二极管阵列检测器。
[0086] 检测时间：80分钟。
[0087] 柱温：30℃；
[0088] 梯度洗脱的方式为：
[0089]
[0090] 4、检测结果
[0091] 批号 维生素K1顺式异构体含量(％) 杂质C(％) 其他单杂(％) 总杂(％)200101 6.6 小于0.05％ 0.1 0.1

[0092] 实施例5
[0093] 1、供试品溶液的制备：
[0094] 取批号200102的维生素K1滴剂胶囊10粒，将内容物倾入100ml量瓶中，囊壳用正己烷分次洗涤，洗液并入量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀。
[0095] 2、维生素K1对照品溶液制备：取维生素K1对照品适量，精密称定，加正己烷溶解制备成浓度为1.0mg/ml的维生素K1标准储备液，然后用体积比为1∶9的中链甘油三酸酯?正己烷溶液定量稀释配制配制成0.05μg/mL的对照品溶液。
[0096] 3、采用高效液相色谱法进行测定，进样量为80μl，高效液相色谱法的色谱条件为：
[0097] 色谱柱：100?5?silica，250mm×4.6mm；
[0098] 流动相：以体积比为1000∶1.4∶0.2的正己烷?正辛醇?甲基叔丁基醚溶液为流动相A，以体积比为96∶4的正己烷?正辛醇溶液为流动相B；采用梯度洗脱方式；
[0099] 检测波长：254nm；
[0100] 流速为1毫升/分；
[0101] 检测器：二极管阵列检测器。
[0102] 检测时间：80分钟。
[0103] 柱温：30℃；
[0104] 梯度洗脱的方式为：
[0105]
[0106] 4、检测结果
[0107] 批号 维生素K1顺式异构体含量(％) 杂质C(％) 其他单杂(％) 总杂(％)200102 6.6 0.1 0.1 0.2

[0108] 实施例6
[0109] 1、供试品溶液的制备：
[0110] 取批号200103的维生素K1滴剂胶囊10粒，将内容物倾入100ml量瓶中，囊壳用正己烷分次洗涤，洗液并入量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀。
[0111] 2、维生素K1对照品溶液制备：取维生素K1对照品适量，精密称定，加正己烷溶解制备成浓度为1.0mg/ml的维生素K1标准储备液，然后用体积比为1∶9的中链甘油三酸酯?正己烷溶液定量稀释配制配制成0.05μg/mL的对照品溶液。
[0112] 3、采用高效液相色谱法进行测定，进样量为80μl，高效液相色谱法的色谱条件为：
[0113] 色谱柱：100?5?silica，250mm×4.6mm；
[0114] 流动相：以体积比为1000∶1.4∶0.2的正己烷?正辛醇?甲基叔丁基醚溶液为流动相A，以体积比为96∶4的正己烷?正辛醇溶液为流动相B；采用梯度洗脱方式；
[0115] 检测波长：254nm；
[0116] 流速为1毫升/分；
[0117] 检测器：二极管阵列检测器。
[0118] 检测时间：80分钟。
[0119] 柱温：30℃；
[0120] 梯度洗脱的方式为：
[0121]
[0122] 4、检测结果
[0123]批号 维生素K1顺式异构体含量(％) 杂质C(％) 其他单杂(％) 总杂(％)
200103 6.6 小于0.05％ 0.1 0.1

[0124] 实施例6
[0125] 方法学研究
[0126] 1、仪器与试药
[0127] 仪器：Agilent1200高效色相色谱仪，XA205DU电子天平
[0128] 试药：维生素K1(批号100156?201806，含量99.7％，中国食品药品检定研究院)；维生素K1顺式异构体(含量95％以上，深圳博泰尔生物技术有限公司)；稀释剂1为正己烷；稀释液2为中链甘油三酸酯?正己烷(1∶9)。
[0129] 2、色谱条件：用硅胶填充柱，型号为BeconSil100?5?silica，250mm×4.6mm；以正己烷?正辛醇?甲基叔丁基醚(1000∶1.4∶0.2)为流动相A，以正己烷?正辛醇(96∶4)为流动相B；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为254nm，进样体积80μl。按下表进行梯度洗脱。
[0130]
[0131]
[0132] 3、溶液制备
[0133] 维生素K1对照品溶液制备：取维生素K1对照品适量，精密称定，加稀释剂1溶解并稀释，最后一步稀释用稀释剂2定量稀释配制成每1ml中约含维生素K10.2μg的溶液。
[0134] 维生素K1顺式异构体对照品溶液：取维生素K1顺式异构体对照品适量，精密称定，加稀释剂1溶解并稀释，最后一步稀释用稀释剂2定量稀释配制成每1ml中约含维生素K10.1μg的溶液。

[0135] 供试品溶液制备：取本品10粒，将内容物倾入100ml量瓶中，囊壳用稀释剂1分次洗涤，洗液并入量瓶中，用稀释剂1稀释至刻度，摇匀。
[0136] 空白辅料溶液制备：取中链甘油三酸酯1ml，置10ml量瓶中，加稀释剂1溶解并稀释至刻度，摇匀专属性试验。
[0137] 系统适用性溶液制备：取维生素K1对照品适量，加稀释剂2溶解并定量稀释制成每1ml中约含维生素K10.1mg的溶液，在5000lx的照度下照射约10min，即得。光照目的是使得系统适用性溶液中出现一个最大降解杂质，为杂质C。

[0138] 4、维生素K1顺式异构体定位实验
[0139] 将维生素K1顺式异构体对照品溶液注入高效液相色谱仪中，检测获得维生素K1顺式异构体定位图，见图1。从图中可见维生素K1顺式异构体峰及其保留时间。
[0140] 5、系统适用性实验
[0141] 将80μl系统适用性溶液注入高效液相色谱仪中，检测获得系统适用性溶液色谱图，见图2。在图2系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序依次为维生素K1顺式异构体峰、维生素K1反式异构体峰、杂质C峰，各组分间分离度符合规定。
[0142] 6、线性关系考察
[0143] 取维生素K1对照品适量，加稀释剂1溶剂并稀释，最后一步用稀释剂2，制备系列浓度对照品溶液，依法测定，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，维生素K1在0.1156～0.4622μg/ml范围内线性关系良好，线性方程为y＝172.6x?3.468，相关系数r为
0.9993，满足方法学验证要求，结果见表1和图3。

[0144] 表1维生素K1滴剂(胶囊型)有关物质线性考察结果
[0145] 浓度(μg/ml) 平均峰面积
曲线1 0.1156 17.6
曲线2 0.1849 27.4
曲线3 0.2311 35.8
曲线4 0.3467 57.0
曲线5 0.4622 76.4

[0146] 6、检出限及定量限考察
[0147] 精密量取曲线1溶液，逐步稀释至溶液中维生素K1反式异构体峰的信噪比为3时为检出限，信噪比为10时为定量限，结果计算出检出限为0.014μg/ml，定量限为0.047μg/ml。
[0148] 7、稳定性试验
[0149] 取有关物质项下的供试品溶液(使用批号200102的样品)，置室温环境下，考察12小时内样品稳定性，结果见表2。维生素K1顺式异构体和维生素K1反式异构体在12小时内较稳定，峰面积变化RSD％小于3.0％，已知杂质(杂质C)峰面积呈现先增大后减小的趋势，未知杂质峰(保留时间约11.6min)在第6.7小时色谱图峰面积增大，峰面积变化RSD％为17.0％。

[0150] 表2稳定性试验结果
[0151]组分(RSD) 2.7h 4h 9.3h 12h
杂质1 2.2％ 17.0％ 20.8％ 22.0％
维生素K1顺式异构体 0.5％ 1.4％ 2.0％ 2.8％
维生素K1(反式异构体) 0.8％ 1.6％ 2.6％ 2.9％
杂质C 6.6％ 5.8％ 17.3％ 21.3％

[0152] 8、样品中杂质的计算方法
[0153] 供试品溶液色谱图中，扣除空白辅料峰，如有维生素K1顺式异构体峰，其峰面积不得过维生素K1顺式异构体、维生素K1反式异构体峰面积和的15.0％；如有与系统适用性溶液中各组分保留时间一致的色谱峰，按主成分外标法计算，杂质C不得过1.0％，其他单个杂质不得过1.0％，总杂(除顺式异构体外)不得过2.0％，供试品溶液色谱图中小于对照品溶液主峰面积0.25倍(0.05％)的峰忽略不计。
[0154] 9、样品测定
[0155] 按本发明测定方法检测，详见实施例4?5，3批样品均符合标准规定。结果见表3。并附上维生素K1对照品溶液色谱图，见图4；以及批号200101供试品溶液的色谱图，见图5。
[0156] 表3维生素K1滴剂(胶囊型)有关物质测定结果
[0157] 批号 维生素K1顺式异构体含量(％) 杂质C(％) 其他单杂(％) 总杂(％)200101 6.6 小于0.05％ 0.1 0.1
200102 6.6 0.1 0.1 0.2
200103 6.6 小于0.05％ 0.1 0.1

[0158] 10、与中国药典方法对比实验
[0159] 按《中国药典》2020年版二部中规定，维生素K1原料药的高效液相检测方法进行检测，检测色谱图见图6。按本发明实施例4测定方法取200101供试品溶液进行检测，检测色谱图见图7。
[0160] 图6和图7对比可见：图6按中国药典色谱条件进行试验，发现杂质C没有保留，且基线噪音大，影响其他未知杂质的有效检出。而图7，应用了正己烷?正辛醇?甲基叔丁基醚(1000∶1.4∶0.2)为流动相A，以正己烷?正辛醇(96∶4)为流动相B流动相体系，能够使维生素K1两个异构体得到有效的分离，同时能使杂质C在该系统中有保留，且能有效检出其他未知杂质。

专利地区：广西

专利申请日期：2022-04-21

专利公开日期：2023-08-18

专利公告号：CN114965742B