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专利名称：一种生物显微镜的光路对准方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202111250155.7

专利申请（专利权）人：梧州学院
权利人地址：广西壮族自治区梧州市万秀区富民三路82号

专利发明（设计）人：彭国晋,?周信健,?黄家广,?玉振明,?王奎奎

专利摘要：本发明公开了一种生物显微镜的光路对准方法，属于光学仪器设备技术领域；该方法仅基于图像传感器实现4×物镜识别与光路对准，有效降低系统复杂度；包括物镜识别处理和光路对准处理。所述的物镜识别处理含如下步骤：(1)驱动物镜转换器，采集图像；(2)由4×物镜长度和光路系统参数计算过渡帧数量并取整为N′；(3)将光斑图像均分为N′×N′个子块，计算各子块的局部标准差；(4)用二维高斯矩阵调整局部标准差矩阵权重，并计算调整权重后的总标准差；(5)计算光斑图像非零像素比例对50％的接近度因子，与总标准差联合计算得到4×物镜识别判据；(6)设定阈值判别4×物镜；所述的光路对准处理包括粗对准、细对准两个步骤。

主权利要求：一种生物显微镜的光路对准方法
技术领域
[0001] 本发明涉及光学仪器设备的技术领域，更具体地说，尤其涉及一种生物显微镜的光路对准方法。
背景技术
[0002] 根据光学生物显微镜的操作规则，标本观测时应先使用视场较大的低倍物镜执行初始聚焦，搜索观测目标并调整至视野中心，随后切换至高倍物镜进一步观测。而低倍物镜光路对准是该实现观测过程的前提。因此，光学生物显微镜获取清晰图像的完整过程可分解为三个有序的步骤：4×物镜识别、光路对准和聚焦。对于普通生物显微镜，前两个步骤分别通过人眼观测和手动调节低倍物镜移至卡槽内实现，而全自动光学生物显微镜则要求所有步骤自动实现。传统的自动化低倍物镜识别与光路对准方法主要通过增设标记物和检测电路实现，但这类方法会增加全自动光学生物显微镜的结构复杂度。利用光学成像系统基本部件——图像传感器来实现自动化低倍物镜识别与光路对准可有效控制系统结构复杂度。
[0003] 常规光学生物显微物镜包括4×、10×、20×、40×、60×、100×等倍率。其中40×以上物镜光斑极暗，容易区分，而20×以下物镜则容易混淆，尤其是4×、10×两种物镜。由此可见，基于图像传感器的自动化低倍物镜识别实质上是根据成像特性区分4×、10×这两种物镜。而摄像头曝光等级、光源亮度的改变均可能直接影响光斑图像特征，导致难以使用统一的判决阈值在较大的成像条件动态范围下区分出4×或者10×这两种物镜。因此，亟待发明一种生物显微镜的自动识别与光路对准方法，使判决阈值能够适应不同成像条件，以便进一步提升4×物镜识别的鲁棒性。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种生物显微镜的光路对准方法，利用该方法能够基于图像传感器实现4×物镜识别与光路对准，具有搜索收敛速度快、对准精度高的特点。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 一种生物显微镜的光路对准方法，包括物镜识别处理和光路对准处理，所述的物镜识别处理包括如下步骤：
[0007] (1)无试样条件下，驱动物镜转换器转动物镜获取光斑图像A1；
[0008] (2)根据物镜长度和物镜转换器转动速度等系统光路参数计算4×物镜对应的过渡帧数量N；
[0009] (3)将光斑图像A1按过渡帧数量N的取整值N′均分为N′×N′个光斑图像子块，计算各光斑图像子块的局部标准差；
[0010] (4)用N′×N′二维高斯矩阵为不同位置的光斑图像子块的局部标准差分配不同的权重，随后计算调整权重后的局部标准差矩阵的总标准差；
[0011] (5)计算光斑图像非零像素比例对50％的接近度因子，最后4×物镜识别判据由总标准差除以该50％接近度因子得到；
[0012] (6)根据光路系统特性设定物镜识别判据的阈值以识别4×物镜，若大于则进入光路对准处理，否则重复步骤(1)；
[0013] 所述的光路对准处理包括光路粗对准处理和光路细对准处理。
[0014] 进一步的，所述的光路粗对准处理包括如下步骤：
[0015] (1)将所述物镜识别处理的步骤(1)所得光斑图像A1进行预处理得光斑预处理图像P1；
[0016] (2)在光斑预处理图像P1中提取出一组同心圆。悦扛鲈不〗卸等分后分别进行圆拟合得到拟合半径和圆心；
[0017] (3)根据两个拟合半径、圆心的差值确定该段圆弧的对称度，并据此为该圆弧分配权值，通过各段圆弧圆心位置的加权估计出A1光斑中心位置C1；
[0018] (4)驱动物镜转换器转动角度β，获取光斑图像A2，对光斑图像A2采用与光斑图像A1相同的处理方法，估计出A2对应的光斑中心位置C2；
[0019] (5)根据光斑中心位置C1和光斑中心位置C2估计出光斑中心运动轨迹，根据该轨迹计算C2移至图像中心位置所需的物镜转换器转动角度β′，驱动物镜转换器转动角度β′。
[0020] 进一步的，所述的光路细对准处理包括如下步骤：
[0021] (1)驱动物镜转换器转动角度α，其中每转动0.86°，获取光斑图像Bm，将光斑图像Bm进行灰度化处理后计算光斑图像能量Em和图像能量变化量ΔEm，计算当前物镜位置的光路对准度评价值Sm，其中：
[0022] Sm＝Em/ΔEm；
[0023] (2)对光路对准度评价值Sm取峰值即得最佳光路对准位置。
[0024] 进一步的，所述的物镜识别处理的步骤(2)中，过渡帧个数N的计算方法为：
[0025]
[0026] 其中，HIS为图像传感器高度，HLen为物镜中心点到光轴的垂直距离，LLen为物镜长度，LParfocal为齐焦距离，LCone为镜筒长度，LC为聚光器光线汇聚点到试样正焦平面的距离，ω为物镜转换器的转动角速度。
[0027] 进一步的，所述的物镜识别处理的步骤(4)中，对每一光斑图像子块进行权重计算的公式为：
[0028]
[0029] 其中，TP′i,j为第i,j个光斑图像子块标准差的权重值，σH为预设值；
[0030] 对光斑图像子块权重矩阵的各元素进行归一化处理的计算公式为：
[0031] TPi,j＝TP′i,j/max(TP′i,j)；
[0032] 其中，TPi,j为光斑图像子块权重矩阵第i,j个元素归一化值。
[0033] 进一步的，所述的物镜识别处理的步骤(5)中，系统曝光等级、光源亮度分别为Υ和Γ时，4×物镜识别判据 的计算公式为：
[0034]
[0035] 其中，g为光斑图像非零像素比例对50％的接近度，计算公式为：
[0036]
[0037] Wim为光斑图像的行像素数量，Him为光斑图像的列像素数量；
[0038]
[0039] I(k,l)为光斑图像第k行l列的像素灰度值；
[0040] σ′i,j为σi,j的权重处理值，计算公式为：
[0041] σ′i,j＝σi,jTPi,j；
[0042] σi,j是各光斑图像子块的像素标准差，σa是(σ′i,j)2的均值，计算公式为：
[0043]
[0044] 设定4×物镜识别判据阈值为：
[0045]
[0046] 其中 和 分别为4×和10×物镜在不同曝光级、光源亮度条件下的先验判据值。

[0047] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
[0048] 本发明的一种生物显微镜的光路对准方法，通过物镜识别处理，可以由图像传感器获取的光斑图像特征直接判断出所切换的物镜是否为4×物镜，整个识别过程是基于采集的光斑图像序列计算物镜识别判断参数值而实现判断，不需要增设标记物和检测电路，减少了光学生物显微镜的结构复杂度；通过光路对准处理中的光路粗对准处理和光路细对准处理实现4×物镜光路对准，搜索收敛速度更快，对准精度更高。
附图说明
[0049] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0050] 图1是物镜光路偏离模型示意图；
[0051] 图2是光斑图像中的光斑图像子块分布示意图；
[0052] 图3是光斑图像预处理过程示意图；
[0053] 图4是圆弧处理过程示意图；
[0054] 图5是二分圆弧圆拟合示意图；
[0055] 图6是光斑圆心运动轨迹示意图。
具体实施方式
[0056] 下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0057] 本发明的一种生物显微镜的光路对准方法，包括物镜识别处理和光路对准处理，所述的物镜识别处理包括如下步骤：
[0058] (1)无标本条件下，驱动物镜转换器转动物镜获取光斑图像A1。
[0059] (2)根据物镜长度和物镜转换器转动速度等系统光路参数计算4×物镜对应的过渡帧数量N。
[0060] 参照图1的物镜光路偏离模型所示，聚光器将光源发出的光线汇聚至光线汇聚点A，经物镜中心点C的光线，传播至像平面，形成光斑中心点F。HLen为物镜中心点C到光轴的垂直距离，LLen为物镜长度，LParfocal为齐焦距离，LCone为镜筒长度，LC为聚光器光线汇聚点A到试样正焦位置的距离。HIS为图像传感器高度，HImage为光斑中心F到光轴的垂直距离。α为物镜光轴与系统光轴的夹角。
[0061] 由三角形相似可得：
[0062]
[0063] 光斑的移动速度为v。由于光路接近对齐时，光斑形变较。扇衔獍咧行牡鉌与光斑边缘的移动速度一致，则光斑边缘的移动速度为：
[0064]
[0065] 此时，α很小。由 有cosωt≈1，故v表达式可简化为
[0066]
[0067] 其中，过渡帧个数N的计算方法为：
[0068]
[0069] 其中，HIS为图像传感器高度，HLen为物镜中心点到光轴的垂直距离，LLen为物镜长度，LParfocal为齐焦距离，LCone为镜筒长度，LC为聚光器光线汇聚点到试样正焦平面的距离，ω为物镜转换器的转动角速度。
[0070] (3)将光斑图像A1按过渡帧数量N的取整值N′均分为N′×N′个光斑图像子块，计算各光斑图像子块的局部标准差。
[0071] 4×物镜的过渡帧数量为N个，光斑图像子块的个数为N′×N′个，其中N′为N的取整，即将光斑图像A1均分为N′×N′个光斑图像子块，如图2所示。
[0072] (4)用N′×N′二维高斯矩阵为不同位置的光斑图像子块的局部标准差分配不同的权重，随后计算调整权重后的局部标准差矩阵的总标准差。
[0073] 其中，对每一光斑图像子块进行权重计算的公式为：
[0074]
[0075] 其中，TP′i,j为第i,j个光斑图像子块标准差的权重值，σH为预设值；
[0076] 对每一光斑图像子块进行归一化处理的计算公式为：
[0077] TPi,j＝TP′i,j/max(TP′i,j)(6)
[0078] 其中，TPi,j为光斑图像子块权重矩阵第i,j个元素归一化值。
[0079] (5)计算光斑图像非零像素比例对50％的接近度因子，最后系统曝光等级、光源亮度分别为Υ和Γ时的4×物镜识别判据 由总标准差除以该50％接近度因子得到。
[0080]
[0081] 其中，g为光斑图像非零像素比例对50％的接近度，计算公式为：
[0082]
[0083] Wim为光斑图像的行像素数量，Him为光斑图像的列像素数量。
[0084]
[0085] I(k,l)为光斑图像第k行l列的像素灰度值。
[0086] σ′i,j为σi,j的权重处理值，计算公式为：
[0087] σ′i,j＝σi,jTPi,j(10)
[0088] σi,j是各光斑图像子块的像素标准差，σa是(σ′i,j)2的均值，计算公式为：
[0089]
[0090] 设定阈值为：
[0091]
[0092] 其中 和 分别为4×和10×物镜在不同曝光级、光源亮度条件下的先验判据值。驱动物镜转换器转动切换物镜，并实时统计采集光斑图像的

[0093] (6)根据光路系统特性设定4×物镜识别判据的阈值以识别4×物镜，若大于则进入光路对准处理，否则重复步骤(1)。
[0094] 当 时，即可认为当前的光斑为4×物镜所呈光斑，随后进入光路对准处理步骤。
[0095] 所述的光路对准处理包括光路粗对准处理和光路细对准处理。
[0096] 其中，所述的光路粗对准处理包括如下步骤：
[0097] (1)将所述物镜识别处理的步骤(1)所得光斑图像A1进行预处理得到预处理图像P1。
[0098] 如图3所示，对某原始光斑图像(a)进行灰度化处理，再进行中值滤波器平滑，得到光斑预处理图像(b)。
[0099] (2)在P1中提取出一组同心圆。悦扛鲈不〗卸等分后分别进行圆拟合得到拟合半径和圆心。
[0100] 对光斑预处理图像(b)进行圆弧提。髟不≡谕枷癖咴荡τ谐啥远说，如图3(c)所示。
[0101] 如图4所示，提取第n段圆弧为为ARCn，记为AD，其端点分别为A、D。该对端点所确定的直线方程为z0＝kADx+c?y。将圆弧上所有点(假设有r个点)的坐标代入直线方程中，得到一组z0。利用下式计算得到一个q序列
[0102]
[0103] 利用下式计算得到s序列[s0,s1...sk...sr?2]
[0104] sk＝|qk+qk+1|,k∈[0,r?2](14)
[0105] S序列中的0或1表示经圆弧端点的直线与弧线的交点。若除端点以外，直线与圆弧仍有交点，如图4中的B、C点，则选择与原端点最近两个交点作为新的圆弧端点；否则保持原有的圆弧端点。计算圆弧端点的中心位置，并确定中垂线方程z1＝kMNx+c?y。
[0106] (3)根据两个拟合半径、圆心的差值确定该段圆弧的对称度，并据此为该圆弧分配权值。通过各段圆弧圆心位置的加权估计出A1光斑中心位置C1。
[0107] 把新端点对应的长圆弧上各点坐标代入中垂线方程中，按公式(11)(12)的方法确定中垂线与圆弧的交点N。此时圆弧被平分成BN和NC两段。对BN，NC，BC分别进行最小二乘圆拟合，如图5所示，得到三个圆心，记为O1n，O2n，O3n，其中O1n与O2n的欧氏距离记为Dn。三个拟合圆的半径为R1n，R2n，R3n。
[0108] 此时O3n的有效性由下式得到：
[0109]
[0110] ARCn对应的权重由下式得到：
[0111]
[0112] 按上述的圆弧权重计算方式计算所有提取圆弧(ARC1...ARCn...ARCT)的权重，最后图像对应光斑中心位置C1(XOi,YOi)估计值由下式给出
[0113]
[0114] 其中，(*)T表示矩阵转置。
[0115] (4)驱动物镜转换器转动角度β，获取光斑图像A2，对光斑图像A2采用与光斑图像A1相同的处理方法，估计出A2对应的光斑中心位置C2。
[0116] (5)根据光斑中心位置C1和光斑中心位置C2估计出光斑中心运动轨迹，根据该轨迹计算C2移至图像中心位置所需的物镜转换器转动角度β′，驱动物镜转换器转动角度β′。
[0117] 光斑中心运动轨迹如图6所示，其轨迹方程如下式得到：
[0118]
[0119] 根据光斑圆心轨迹方程，计算该轨迹与图像边缘的交点C3、C4，以及C3和C4的中心位置C5。此时光斑圆心处于C2位置，将光斑圆心位置从C2移至C5所需的物镜转换器转动角度由下式计算得到
[0120]
[0121] 将物镜转换器继续转动β′，即完成光路粗对准。
[0122] 所述的光路细对准处理包括如下步骤：
[0123] (1)驱动物镜转换器转动角度α，其中每转动0.86°，获取显微图像后识别出光斑图像Bm，将光斑图像Bm进行灰度化处理后计算光斑图像能量Em，计算当前物镜位置的光路对准度评价值Sm。
[0124] 光斑图像能量Em的计算公式为：
[0125]
[0126] 其中m为光路细对准处理过程中采集的第m幅光斑图像，I(k,l)表示光斑图像第k行l列的像素灰度值。随后由式(20)计算得到当前物镜位置的光路对准度评价值Sm。继续转动角度0.86°，采集图像并重复对准度评价，最后得到光路对准度评价曲线。
[0127]
[0128] (2)对光路对准度评价值Sm取峰值即得最佳光路对准位置。
[0129] 所得光路对准度评价曲线的峰值处对应的物镜位置即为最佳光路对准位置。
[0130] 本发明的一种生物显微镜的光路对准方法，通过物镜识别处理，通过物镜识别处理，可以由图像传感器获取的光斑图像特征直接判断出所切换的物镜是否为4×物镜，整个识别过程是基于采集的光斑图像序列计算物镜识别判断参数值而实现判断，不需要增设标记物和检测电路，减少了光学生物显微镜的结构复杂度；通过光路对准处理中的光路粗对准处理和光路细对准处理实现4×物镜光路对准，搜索收敛速度更快，对准精度更高。
[0131] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

专利地区：广西

专利申请日期：2021-10-26

专利公开日期：2023-09-12

专利公告号：CN113933985B