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专利名称：柠檬苦素衍生物及其制备方法和用途

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202110703332.6

专利申请（专利权）人：内蒙古民族大学
权利人地址：内蒙古自治区通辽市科尔沁区西拉木轮大街996号

专利发明（设计）人：卞明,马茜茜

专利摘要：本发明公开了一种柠檬苦素衍生物及其制备方法和用途。本发明的柠檬苦素衍生物，具有良好的抗炎活性。

主权利要求：柠檬苦素衍生物及其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明涉及一种柠檬苦素衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
[0002] 炎症是机体的一种保护性反应，但持续的炎症反应会损害组织，甚至导致功能丧失，肿瘤和死亡。抗炎药可以分为甾体抗炎药和非甾体抗炎药。甾体抗炎药是最早用于治疗炎症的药物，但甾体抗炎药易引起并发症，限制了这类药物的临床使用。目前非甾体抗炎药是全球使用最广泛的药物，尽管这类药物具有有效的消炎、镇痛和解热活性，但是也具有较大的副作用，例如肠道并发症、肾功能衰竭和心力衰竭。
[0003] 柠檬苦素是一种天然的三萜类化合物，广泛存在于可食用的水果和蔬菜中，其具有抗炎活性，并具有疗效确切、副作用小的特点。但是，由于柠檬苦素药效不够强，生物利用度低，限制了其临床应用。
[0004] CN111574533A公开了一种柠檬苦素A环开环胺化衍生物或其药学上可接受的盐，提高了止痛和抗炎活性。CN106928311A公开了一种柠檬苦素衍生物，其在柠檬苦素的23位上修饰，以提高柠檬苦素的抗炎和镇痛活性。CN10358854A公开了一种在柠檬苦素肟醚衍生物，将各种叔胺引入7位的碳原子上，以提高柠檬苦素的抗炎和镇痛活性。CN108003218A公开了一种柠檬苦素A环氨裂解衍生物，其具有治疗炎症和疼痛方面的用途。CN104744558A公开了一种柠檬苦素?7?氨基衍生物，其具有镇痛和抗炎的作用。但是，上述专利文献对于柠檬苦素衍生物的毒性研究较少。化合物能否作为药物，其安全性和有效性均是非常重要的考察因素。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐，其具有抗炎活性，而且毒性较低。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供上述柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法，其工艺简单且稳定。
[0007] 本发明再一个目的在于提供上述柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐在制备具有抗炎活性药物中的用途。
[0008] 一方面，本发明提供一种如式(I)柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐，
[0009]
[0010] 式(I)中，R1～R5、R7和R9相同或不同，分别独立地选自氢、卤素、C1?C6烷基、C2?C6杂烷基、C3?C6环烷基、C1?C6烷氧基或C1?C6烷硫基；R6和R8相同或不同，分别独立地选自氢、卤素、C1?C6烷基、C1?C6烷氧基或C1?C6烷硫基。
[0011] 根据本发明的柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐，优选地，R1～R9相同或不同，分别独立地选自氢或C1?C6烷基。
[0012] 根据本发明的柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐，优选地，R1～R9相同或不同，分别独立地选自氢或C1?C3烷基。
[0013] 根据本发明的柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐，优选地，式(I)所示的化合物为：
[0014]
[0015] 根据本发明的柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐，优选地，式(I)所示的化合物为：
[0016]
[0017] 根据本发明的柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐，优选地，所述药学上可接受的盐选自该化合物与磷酸、硫酸、盐酸、醋酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、谷氨酸形成的盐，或者该化合物与上述酸成
[0018] 酯或酰胺后再与无机碱形成的钠、钾、钙、铝或铵盐。
[0019] 另一方面，本发明提供上述柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法，包括如下步骤：
[0020] 将式(II)所示的化合物与式(III)所示的化合物反应，得到柠檬苦素衍生物；
[0021]
[0022] 其中，R1～R5、R7和R9相同或不同，分别独立地选自氢、卤素、C1?C6烷基、C2?C6杂烷基、C3?C6环烷基、C1?C6烷氧基或C1?C6烷硫基；R6和R8相同或不同，分别独立地选自氢、卤素、C1?C6烷基、C1?C6烷氧基或C1?C6烷硫基。
[0023] 根据本发明的制备方法，优选地，所述式(II)所示的化合物由如下方法制备得到：
[0024] 将式(IV)所示的化合物与盐酸羟胺反应，得到中间体A；将中间体A与式(V)所示的化合物反应，得到式(II)所示的化合物；
[0025]
[0026] 其中，R1、R3～R5、R7和R9相同或不同，分别独立地选自氢、卤素、C1?C6烷基、C2?C6杂烷基、C3?C6环烷基、C1?C6烷氧基或C1?C6烷硫基；R6和R8相同或不同，分别独立地选自氢、卤素、C1?C6烷基、C1?C6烷氧基或C1?C6烷硫基。
[0027] 再一方面，本发明还提供上述柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐在制备具有抗炎作用的药物中的用途。
[0028] 根据本发明的用途，优选地，所述柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐通过抑制NF?κB和/或MAPK通路达到抗炎作用。
[0029] 本发明通过对柠檬苦素及其衍生物的7位上的羰基进行结构修饰，提高了柠檬苦素的抗炎活性且降低了毒性，这样有望成为抗炎药物。
附图说明
[0030] 图1为柠檬苦素组和柠檬苦素衍生物f4组的细胞生长量占空白对照组的细胞生长量的百分比图；其中，CON表示空白对照组，Limonin表示柠檬苦素组，f4表示柠檬苦素衍生物f4组。
[0031] 图2为各实验组NO的产生量图。
[0032] 图3为各实验组TNF?α的含量图。
[0033] 图4为各实验组IL?1β的含量图。
[0034] 图5为各实验组IL?6的含量图。
[0035] 图6为各实验组的荧光强度图。
[0036] 图7为各实验组iNOS和COX?2表达的蛋白印迹图及统计图；其中，A为各实验组iNOS和COX?2表达的蛋白印迹图，B为各实验组iNOS表达的统计图，C为各实验组COX?2表达的统计图。
[0037] 图8为各实验组p65和IκBa表达的蛋白印迹图及统计图；其中，A为各实验组p65和IκBa表达的蛋白印迹图，B为各实验组p65表达的统计图，C为各实验组IκBa表达的统计图。
[0038] 图9为各实验组p38和JNK表达的蛋白印迹图及统计图；其中，A为各实验组p38和JNK表达的蛋白印迹图，B为各实验组JNK表达的统计图，C为各实验组p38表达的统计图。
[0039] 图10为各实验组小鼠肺部组织的显微照片图。
[0040] 图11为各实验组小鼠损伤评分图。
[0041] 图12为各实验组肺组织的湿/干重量比。
[0042] 图13为各实验组小鼠支气管肺泡洗液中或血清中NO的产量及IL?6、TNF?α的含量；其中，A为各实验组小鼠支气管肺泡洗液中NO的产量，B为各实验组小鼠支气管肺泡洗液中IL?6的含量，C为各实验组小鼠支气管肺泡洗液中TNF?α的含量，D为各实验组小鼠血清中NO的产量，E为各实验组小鼠血清中IL?6的含量，F为各实验组小鼠血清中TNF?α的含量。

[0043] 图14为各实验组小鼠肺组织中iNOS和COX?2表达的蛋白印迹图及统计图；其中，A为各实验组小鼠肺组织中iNOS和COX?2表达的蛋白印迹图，B为各实验组小鼠肺组织中iNOS表达的统计图，C为各实验组小鼠肺组织中COX?2表达的统计图。
[0044] 图15为各实验组小鼠肺组织中p65、IκBa、p38和JNK表达的蛋白印迹图及统计图；其中，A为各实验组小鼠肺组织中p65和IκBa表达的蛋白印迹图，B为各实验组小鼠肺组织中p65表达的统计图，C为各实验组小鼠肺组织中IκBa表达的统计图，D为各实验组小鼠肺组织中p38和JNK表达的蛋白印迹图，E为各实验组小鼠肺组织中JNK表达的统计图，F为各实验组小鼠肺组织中p38表达的统计图。

[0045] 图16A为各浓度柠檬苦素衍生物f4下，受精后时间与存活率的关系图。
[0046] 图16B为各浓度柠檬苦素下，受精后时间与存活率的关系图。
[0047] 图16C为各浓度塞来昔布下，受精后时间与存活率的关系图。
[0048] 图16D为72hpf时，心率与药物浓度的关系图。其中，Control表示空白对照组，lim表示柠檬苦素组，cel表示塞来昔布组，f4表示柠檬苦素衍生物f4组。除Control外，其余各组中的首位数字表示药物浓度，例如5?lim表示柠檬苦素的药物浓度为5μM。
具体实施方式
[0049] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0050] 本申请的发明人在深入研究柠檬苦素衍生物的过程中惊喜地发现，经过特定基团修饰的柠檬苦素衍生物具有良好的抗炎活性，且毒性低，从而完成本发明。
[0051] <术语解释>
[0052] 在本发明中，Cm?Cn表示具有m～n个碳原子；举例来说，C1?C10烷基表示具有1～10个碳原子的烷基。
[0053] 在本发明中，“烷基”表示具有一个连接点的、衍生自直链的或支链的脂族烃的基团。“杂烷基”表示具有一个连接点的、具有至少一个杂原子的烷基。“杂原子”选自氧、氮、硫、磷或卤素原子。“环烷基”表示具有一个连接点的、衍生自脂族环烃的基团。前缀“杂”表示一个或多个碳原子已被不同的原子置换。“卤素”表示F、Cl、Br、I。除非特别声明，所有基团可为取代或未取代的。取代基选自卤素、C1?C6烷基、C1?C6烷氧基、C6?C20芳基、硝基、氰基、氨基、羟基、羧基、卤代C1?C6烷基。
[0054] 除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可用于本发明的实施或测试中，但是下文描述了合适的方法和材料。所有的出版物、专利申请、专利、以及本文提及的其它参考资料均以引用方式全文并入本文。如发生矛盾，以本说明书及其包括的定义为准。此外，材料、方法、制备例和实施例仅是示例性的，并不旨在进行限制。
[0055] <柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐>
[0056] 本发明的柠檬苦素衍生物具有式(I)所示的结构：
[0057]
[0058] 在本发明中，R1～R5、R7和R9相同或不同，分别独立地选自氢、卤素、C1?C6烷基、C2?C6杂烷基、C3?C6环烷基、C1?C6烷氧基或C1?C6烷硫基；R6和R8相同或不同，分别独立地选自氢、卤素、C1?C6烷基、C1?C6烷氧基或C1?C6烷硫基。
[0059] 在本发明中，卤素包括但不限于氟、氯、溴、碘。在某些实施方式中，卤素可以选自氟或氯。
[0060] 在本发明中，C1?C6烷基可以包括但不限于直链烷基或支链烷基；优选为C1?C3烷基，更优选为C1?C3直链烷基。C1?C6烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、己基等。此外，本发明的C1?C6烷基可以包括取代的烷基或未取代的烷基。取代的烷基中的取代基可以含有杂原子，例如O、S、N、P或卤素原子。卤素原子包括但不限于氟、氯、溴、碘。
[0061] 在本发明中，C2?C6杂烷基可以包括但不限于直链杂烷基或支链杂烷基；优选为C2?C5杂烷基，更优选为C2?C3杂烷基。本发明的杂烷基是指烷基链上的碳原子被其他杂原子取代形成的基团。上述杂原子包括O、S或N，优选包括O或S。本发明的C2?C6杂烷基具体的实例包括但不限于?CH2?O?CH3、?CH2?O?CH2CH3、?CH2?O?CH(CH3)CH3、?CH2?S?CH3、?CH2?S?CH2CH3、?CH2?S?CH(CH3)CH3。
[0062] 在本发明中，C3?C6环烷基可以包括取代的环烷基和未取代的环烷基；优选为C5?C6环烷基，更优选为C5环烷基。本发明的C3?C6环烷基具体的实例包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、3?甲基环戊基、3?甲基环己基、3?乙基环己基，优选为环戊基、环己基。
[0063] 在本发明中，C1?C6烷氧基可以包括但不限于直链烷氧基或支链烷氧基；优选为C1?C3烷氧基，更优选为C1?C3直链烷氧基。C1?C6烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基等。
[0064] 在本发明中，C1?C6烷硫基可以包括但不限于直链烷硫基或支链烷硫基；优选为C1?C3烷硫基，更优选为C1?C3直链烷硫基。C1?C6烷硫基的实例包括但不限于甲硫基、乙硫基、正丙硫基、异丙硫基、正丁硫基、异丁硫基、叔丁硫基、正戊硫基、异戊硫基、新戊硫基、己硫基等。
[0065] 根据本发明的一个具体实施方式，R1～R9分别独立地选自氢、甲基或乙基。
[0066] 本发明的化合物可以为：
[0067]
[0068] 优选地，本发明化合物为：
[0069]
[0070] 本发明的化合物可以形成药学上可接受的盐，所述药学上可接受的盐是指式(I)所示的化合物与磷酸、硫酸、盐酸等无机酸，或醋酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸等有机酸，或天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成的盐，或与上述酸成酯或酰胺后再与无机碱形成的盐，如钠、钾、钙、铝或铵盐。
[0071] <制备方法>
[0072] 本发明的柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法包括如下步骤：将式(II)所示的化合物与式(III)所示的化合物反应，得到柠檬苦素衍生物。
[0073] 在本发明中，式(II)和式(III)所示的化合物具有如下所示的结构：
[0074]
[0075] 其中，R1～R5、R7和R9相同或不同，分别独立地选自氢、卤素、C1?C6烷基、C2?C6杂烷基、C3?C6环烷基、C1?C6烷氧基或C1?C6烷硫基；R6和R8相同或不同，分别独立地选自氢、卤素、C1?C6烷基、C1?C6烷氧基或C1?C6烷硫基。
[0076] 在式(II)和(III)中，R1～R9可以分别独立地选自氢、C1?C6烷基。优选地，R1～R9可以分别独立地选自氢、C1?C3烷基。
[0077] 在式(II)和(III)中，C1?C6烷基可以包括但不限于直链烷基或支链烷基；优选为C1?C3烷基，更优选为C1?C3直链烷基。C1?C6烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、己基等。此外，本发明的C1?C6烷基可以包括取代的烷基或未取代的烷基。取代的烷基中的取代基可以含有杂原子，例如O、S、N、P或卤素原子。卤素原子包括但不限于氟、氯、溴、碘。C2?C6杂烷基可以包括但不限于直链杂烷基或支链杂烷基；优选为C2?C5杂烷基，更优选为C2?C3杂烷基。本发明的杂烷基是指烷基链上的碳原子被其他杂原子取代形成的基团。上述杂原子包括O、S或N，优选包括O或S。本发明的C2?C6杂烷基具体的实例包括但不限于?CH2?O?CH3、?CH2?O?CH2CH3、?CH2?O?CH(CH3)CH3、?CH2?S?CH3、?CH2?S?CH2CH3、?CH2?S?CH(CH3)CH3。C3?C6环烷基可以包括取代的环烷基和未取代的环烷基；优选为C5?C6环烷基，更优选为C5环烷基。本发明的C3?C6环烷基具体的实例包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、3?甲基环戊基、3?甲基环己基、3?乙基环己基，优选为环戊基、环己基。C1?C6烷氧基可以包括但不限于直链烷氧基或支链烷氧基；优选为C1?C3烷氧基，更优选为C1?C3直链烷氧基。C1?C6烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基等。C1?C6烷硫基可以包括但不限于直链烷硫基或支链烷硫基；优选为C1?C3烷硫基，更优选为C1?C3直链烷硫基。C1?C6烷硫基的实例包括但不限于甲硫基、乙硫基、正丙硫基、异丙硫基、正丁硫基、异丁硫基、叔丁硫基、正戊硫基、异戊硫基、新戊硫基、己硫基等。根据本发明的一个具体实施方式，R1～R7分别独立地选自氢、甲基或乙基。

[0078] 式(II)所示的化合物中，当R3、R4、R8、R6为甲基，R5、R7、R9为氢时，其为7位上的羰基被修饰的柠檬苦素。优选地，式(II)中R1为氢。
[0079] 式(III)所示的化合物为叠氮化芳基物，其可以与式(II)所示的化合物的炔基发生加成反应，以形成三氮唑。其中，R2可以为甲基。
[0080] 在本发明中，式(II)所示的化合物与式(III)所示的化合物的摩尔比可以为1:1～2.5，优选为1:1.5～2.2，更优选为1:2。反应可以在水和叔丁醇(t?BuOH)溶剂中进行。反应可以在抗坏血酸钠和CuSO4·5H2O的存在下进行。

[0081] 根据本发明的一个实施方式，向式(II)所示化合物的H2O和t?BuOH溶液中，加入抗坏血酸钠和CuSO4·5H2O，然后加入式(III)所示的化合物，使反应混合物在30～45℃下反应直至完成，得到反应产物。将反应产物萃取、干燥、纯化，得到柠檬苦素衍生物。反应产物可以用二氯甲烷萃取。萃取可以进行多次，例如三次。萃取后将有机层合并。合并后的有机层可以用无水硫酸钠干燥。将干燥后的反应产物可以通过柱色谱法纯化。
[0082] 在本发明中，式(II)所示的化合物可以通过如下方法制备得到：将式(IV)所示的化合物与盐酸羟胺反应，得到中间体A；将中间体A与式(V)所示的化合物反应，得到式(II)所示的化合物。
[0083] 在本发明中，式IV所示的化合物具有如下所示的结构：
[0084]
[0085] 式IV中，R3～R5、R7和R9相同或不同，分别独立地选自氢、卤素、C1?C6烷基、C2?C6杂烷基、C3?C6环烷基、C1?C6烷氧基或C1?C6烷硫基；R6和R8相同或不同，分别独立地选自氢、卤素、C1?C6烷基、C1?C6烷氧基或C1?C6烷硫基。
[0086] 式IV所示的化合物的7位上的羰基与盐酸羟胺发生取代反应，生成肟，形成中间体A。
[0087]
[0088] 在式IV中，R3～R9可以分别独立地选自氢、C1?C6烷基。优选地，R3～R9可以分别独立地选自氢、C1?C3烷基。在式IV中，当R3、R4、R6和R8分别为甲基，且R5、R7和R9分别为氢时，表示柠檬苦素。当R3～R9为其他取代基，表示化学修饰的柠檬苦素。可以采用本领域常规的方法将取代基接到相应的位置，这里不再赘述。
[0089] 在本发明中，式V的化合物的结构如下所示。式V中的Br基团能够与中间体A的7位上的羟基发生取代反应，生成式(II)所示的化合物。式V中，R1可以选自氢、卤素、C1?C6烷基、C2?C6杂烷基、C3?C6环烷基、C1?C6烷氧基或C1?C6烷硫基；优选地，R1选自氢、C1?C6烷基；更优选地，R1选自氢、C1?C3烷基。当R1为氢时，式(V)为3?溴丙炔。
[0090]
[0091] 在本发明中，C1?C6烷基可以包括但不限于直链烷基或支链烷基；优选为C1?C3烷基，更优选为C1?C3直链烷基。C1?C6烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、己基等。此外，本发明的C1?C6烷基可以包括取代的烷基或未取代的烷基。取代的烷基中的取代基可以含有杂原子，例如O、S、N、P或卤素原子。本发明的卤素原子包括但不限于氟、氯、溴、碘。C2?C6杂烷基可以包括但不限于直链杂烷基或支链杂烷基；优选为C2?C5杂烷基，更优选为C2?C3杂烷基。本发明的杂烷基是指烷基链上的碳原子被其他杂原子取代形成的基团。上述杂原子包括O、S或N，优选包括O或S。本发明的C2?C6杂烷基具体的实例包括但不限于?CH2?O?CH3、?CH2?O?CH2CH3、?CH2?O?CH(CH3)CH3、?CH2?S?CH3、?CH2?S?CH2CH3、?CH2?S?CH(CH3)CH3。C3?C6环烷基可以包括取代的环烷基和未取代的环烷基；优选为C5?C6环烷基，更优选为C5环烷基。本发明的C3?C6环烷基具体的实例包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、3?甲基环戊基、3?甲基环己基、3?乙基环己基，优选为环戊基、环己基。C1?C6烷氧基可以包括但不限于直链烷氧基或支链烷氧基；优选为C1?C3烷氧基，更优选为C1?C3直链烷氧基。C1?C6烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基等。C1?C6烷硫基可以包括但不限于直链烷硫基或支链烷硫基；优选为C1?C3烷硫基，更优选为C1?C3直链烷硫基。C1?C6烷硫基的实例包括但不限于甲硫基、乙硫基、正丙硫基、异丙硫基、正丁硫基、异丁硫基、叔丁硫基、正戊硫基、异戊硫基、新戊硫基、己硫基等。根据本发明的一个具体实施方式，R1～R7分别独立地选自氢、甲基或乙基。

[0092] 在本发明中，式(IV)所示的化合物与盐酸羟胺的摩尔比可以为1:(6～10)；优选为1:(7～9)。反应可以在吡啶与无水乙醇溶剂中进行。

[0093] 根据本发明的一个实施方式，将式(IV)所示的化合物与盐酸羟胺，以吡啶与无水乙醇为溶剂下反应1.5～5小时，得到反应产物。将反应产物萃取、洗涤、干燥、蒸发溶剂和重结晶得到中间体A。反应产物可以用乙醚萃取。将萃取后的反应产物用稀盐酸洗涤，以除去过量的吡啶；然后用饱和NaHCO3溶液和盐水洗涤。洗涤后的反应产物用无水Na2SO4干燥，然后蒸空蒸发溶剂以获得中间体A的粗产物。将中间体A的粗产物用乙醇重结晶，得到中间体A。
[0094] 在本发明中，中间体A与式(V)所示的化合物的摩尔比可以为1:(2～4)；优选为1:(2.5～3.5)。反应可以在四氢呋喃溶剂中进行。反应可以在NaH和四丁基溴化铵(TBAB)的存在下进行。

[0095] 将中间体A与式(V)所示的化合物以四氢呋喃为溶剂，在NaH和TBAB存在下反应，得到反应产物。蒸发反应产物中的溶剂，然后用水稀释，将水层萃。谢阆吹、干燥、纯化，得到式(II)所示的化合物。TBAB的用量为催化量。萃取剂可以为二氯甲烷。萃取可以进行多次，例如三次。萃取后将有机层合并。合并后的有机层可以用盐水洗涤，硫酸镁干燥并蒸发至干。将干燥后的反应产物可以通过柱色谱法纯化。
[0096] <用途>
[0097] 本发明的柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐具有抗炎活性，因而本发明提供上述柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐在制备具有抗炎作用的药物中的用途。本发明的柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐可用于炎症的临床治疗，例如急性肺损伤。本发明的柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐通过抑制NF?κB和/或MAPK通路达到抗炎作用。
[0098] 将本发明的柠檬苦素衍生物或其药学上可接受的盐与常规的药学上可接受的载体、赋形剂或辅料混合，得到药物组合物。以上载体、赋形剂或辅料包括但不限于：填料或增容剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、缓溶剂、吸收加速剂、润湿剂、吸附剂或润滑剂。
[0099] 实施例1
[0100] 将柠檬苦素(47.1mg，0.1mmol)和盐酸羟胺(55.6mg，0.8mmol)的溶液溶解在吡啶(8mL)和无水乙醇(15mL)中，然后加热回流2.5小时。通过TLC监测反应，待反应结束后，用乙醚萃取反应产物，用稀盐酸洗涤过量的吡啶，然后用饱和NaHCO3溶液和盐水洗涤；洗涤后的反应产物用无水Na2SO4干燥，然后真空蒸发溶剂，得中间体A的粗产物；将中间体A的粗产物用乙醇重结晶得中间体A(收率：94％)。
[0101] 向中间体A(242.8mg，0.5mmol)的无水THF(25ml)溶液中加入NaH(240mg，10mmol)，然后在室温搅拌30分钟；再加入3?溴丙炔(178.4mg，1.5mmol)和TBAB(催化量)，加热至回流并通过薄层色谱法(TLC)监测，至反应完成。蒸发反应产物中的溶剂，然后用水(30ml)稀释。水层用二氯甲烷萃取三次，合并的有机层并用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，蒸发至干，得式(II)化合物的粗产物。通过柱色谱法纯化式(II)化合物的粗产物，得到式(II)化合物(收率：75％)。

[0102] 向式(II)化合物(157.1mg，0.3mmol)的H2O和t?BuOH溶液(H2O和t?BuOH的体积比为1:1，8ml)中，加入抗坏血酸钠(5.9mg，0.03mmol)和CuSO4·5H2O(7.5mg，0.03mmol)，然后加入式1所述的叠氮化芳基物(0.6mmol)，并使反应混合物在37℃下反应直至完成，通过TLC监测。将反应产物用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，并将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，并通过柱色谱法纯化，得到化合物f4(收率：71％)。

[0103]
[0104]
[0105] f4结构鉴定数据如下：
[0106] (12S，12aS，Z)?8?((((1?(4?甲氧基苯基)?1H?1,2,3?三唑?4?基)甲氧基)亚氨基)?12?(呋喃?3?基)?6,6,8a，12a?四甲基十二烷基?1H，3H?oxireno[2,3?d]吡喃[4'，3'：3,3a]异苯并呋喃[5,4?f]异戊烯?3,10(9aH)?二酮(f4)

[0107] 浅黄色粉末；m.p.＝147.2?149.1℃；1HNMR(300MHz,CDCl3)δ8.44(s,1H),7.85(d,J＝9.1Hz,2H),7.37?7.34(m,1H),7.26(s,1H),7.05(d,J＝9.1Hz,2H),6.17(s,1H),5.44(s,1H),5.18(d,J＝5.3Hz,2H),4.65(d,J＝12.5Hz,1H),4.30(d,J＝12.8Hz,1H),3.93(s,1H),3.87(s,3H),3.70(s,1H),3.56(d,J＝10.4Hz,1H),2.94(dd,J＝16.8,1.8Hz,1H),2.64
13
(dd,J＝10.8,2.9Hz,1H). CNMR(75MHz,CDCl3)δ169.47,168.06,159.69,159.23,143.10,
140.87,130.48,127.38,121.54,119.83,114.84,114.39,109.51,80.37,79.09,78.46,
66.25,65.74,64.76,60.21,55.62,54.00,49.82,46.07,45.99,37.78,35.78,33.17,
30.26,21.29,21.14,19.71,19.52,17.88.HRMS(ESI)m/zC36H40N4O9Na+(M+Na)+计算值是
695.2688,实测值695.2685.

[0108] 下面详细描述以下实验例的原料：
[0109] 完全培养基为含有10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(美国Beyotime，中国)的Dulbecco改良Eagle培养基(美国Hyclone，美国)。

[0110] 无血清培养基为Dulbecco改良Eagle培养基(美国Hyclone，美国)。
[0111] 实验例1
[0112] 将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞在完全培养基中，于含5％CO2和37℃下培养，以备使用。实验中使用的所有细胞均处于对数生长期，培养瓶中的细胞数约为70％?80％。
[0113] 实验例2
[0114] 通过MTT法分析评估柠檬苦素衍生物诱导的细胞活力：将小鼠单核巨噬细胞4
RAW264.7细胞以1×10细胞/mL的密度接种在96孔板中的完全培养基(100μL/孔)中，并孵育24小时。然后分别加入诱导物柠檬苦素衍生物f4(40μM)或柠檬苦素(40μM)将细胞用处理
24小时，空白对照组不加入诱导物。将MTT的PBS溶液(5mg/mL)以10vol％孔体积的用量加入到每个孔中，并将细胞进一步温育4小时。除去上清液，并用150μL/孔DMSO裂解细胞。在酶标仪(ThermoScientific，Waltham，MA，USA)上在570nm(测量波长)和630nm(参考波长)处测量光密度。所得结果如图1所示。柠檬苦素衍生物f4几乎没有细胞毒性。

[0115] 实验例3
[0116] 将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞以每孔1×104个细胞的密度接种到96孔板中。
[0117] 柠檬苦素组(Limonin)和柠檬苦素衍生物f4组(f4)：小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞用40μM的柠檬苦素或柠檬苦素衍生物f4预处理1h，并在含有LPS(1μg/mL)的培养基孵育24h。
[0118] LPS组：小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞不进行预处理，在LPS(1μg/mL)的培养基中孵育24h。
[0119] 空白对照组(CON)：不进行预处理，且不采用LPS刺激。
[0120] 收集各组细胞上清液用于实验。用格里斯试剂测定法(所用仪器，购买自中国Beyotime)测量NO的产生。

[0121] 所得结果如图2所示。由图2可知，柠檬苦素衍生物f4对LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞中NO的分泌具有显著的抑制作用。
[0122] 实验例4
[0123] 将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞以1×104细胞的密度接种到96孔板中。
[0124] 柠檬苦素衍生物f4组(LPS+f4)：用浓度为5，10和20μM的柠檬苦素衍生物f4预处理小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞1h，然后用LPS(1μg/mL)刺激23h。
[0125] 柠檬苦素组(LPS+LIM):用浓度为20μM的柠檬苦素预处理小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞1h，然后用LPS(1μg/mL)刺激23h。

[0126] 塞来昔布组(LPS+CEL):用浓度为10μM的塞来昔布预处理小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞1h，然后用LPS(1μg/mL)刺激23h。

[0127] LPS组：小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞不进行预处理，用LPS(1μg/mL)刺激23h。
[0128] 空白对照组(Control)：不进行预处理，且不用LPS刺激。
[0129] 将各组细胞上清液在4℃下以3000g离心10分钟以去除不溶物，收集上清液并在20℃下保存直至测定细胞因子。ELISA试剂盒根据制造商提供的说明检测TNF?α，IL?6和IL?1β的含量。通过酶标仪分析每个样品在450nm的吸光度。三个独立实验的结果用于统计分析。
[0130] 所得结果如图3?5所示。由图3?5可知，柠檬苦素衍生物f4对LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞中TNF?α，IL?6和IL?1β的分泌具有浓度依赖性，具有良好的抑制作用，比塞来昔布和柠檬苦素效果更好。
[0131] 实验例5
[0132] 将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞以1×104/孔的密度接种到96孔板中。
[0133] 柠檬苦素衍生物f4组(LPS+f4)：用浓度为5，10和20μM的柠檬苦素衍生物f4预处理小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞1h，然后用LPS(1μg/mL)刺激23h。
[0134] 柠檬苦素组(LPS+LIM):用浓度为20μM的柠檬苦素预处理小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞1h，然后用LPS(1μg/mL)刺激23h。

[0135] 塞来昔布组(LPS+CEL):用浓度为10μM的塞来昔布预处理小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞1h，然后用LPS(1μg/mL)刺激23h。

[0136] LPS组：小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞不进行预处理，用LPS(1μg/mL)刺激23h。
[0137] 空白对照组(Control)：不进行预处理，且不采用LPS刺激。
[0138] 除去96个板的每个孔中的培养基，并通过ROS检测试剂盒(Beyotime，中国)确定每个实验组的ROS水平：将50μLRosup添加至阳性对照组反应30分钟；用新鲜的无血清培养基以1：1000稀释2'，7'?二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH?DA)，然后以50μL/孔的用量添加至各孔中。将各组细胞在37℃的细胞培养箱中孵育20分钟，然后用100μL新鲜的无血清培养基在每个孔中洗涤细胞2?3次。最后，使用酶标仪在488nm和525nm的发射波长下实时或逐时检测刺激前后的荧光强度。荧光强度指示ROS的含量。所的结果如图6所示。
[0139] 由图6可知，柠檬苦素衍生物f4对LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞中ROS的产生具有浓度依赖性，具有良好的抑制作用，比塞来昔布和柠檬苦素效果更好。
[0140] 实验例6
[0141] 将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞以1×104/孔的密度接种到96孔板中。
[0142] 柠檬苦素衍生物f4组(LPS+f4)：用浓度为5，10和20μM的柠檬苦素衍生物f4预处理小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞1h，然后用LPS(1μg/mL)刺激23h。
[0143] 柠檬苦素组(LPS+LIM):用浓度为20μM的柠檬苦素预处理小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞1h，然后用LPS(1μg/mL)刺激23h。

[0144] 塞来昔布组(LPS+CEL):用浓度为10μM的塞来昔布预处理小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞1h，然后用LPS(1μg/mL)刺激23h。

[0145] LPS组：小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞不进行预处理，用LPS(1μg/mL)刺激23h。
[0146] 空白对照组(Control)：不进行预处理，且不采用LPS刺激。
[0147] 将细胞在400μLRIPA细胞裂解缓冲液(含PMSF和磷酸酶抑制剂，中国Beyotime)中裂解，并在冰上孵育20分钟。然后将细胞裂解液在4℃下以13,000g离心10分钟以获得细胞溶质级分。通过BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime，中国)测定蛋白质浓度。蛋白质样品在8％?12％SDS?PAGE上电泳，然后转移至PVDF膜(GEHealthcare，UK)。印迹的膜与特定的一抗iNOS，COX?2，p?IκBa，IκBa，p?NF?кBp65，NF?кBp65，p38，p?p38，JNK，p?JNK(CST)在4℃孵育过夜。将膜在TBST(Beyotime，中国)中洗涤3次，在室温下与1：5000稀释的HRP缀合的二抗一起孵育1小时。所得结果如图7?9所示。

[0148] 由图7可知，柠檬苦素衍生物f4以剂量依赖的方式降低iNOS和COX?2的表达。当柠檬苦素衍生物f4的用量为20μM时，iNOS和COX?2表达水平的抑制作用强于塞来昔布和柠檬苦素。
[0149] 由图8可知，柠檬苦素衍生物f4通过抑制IκBa的磷酸化和降解来显着抑制NF?κBp65。实验表明柠檬苦素衍生物f4通过抑制NF?κB信号传导途径抑制了炎症细胞因子。
[0150] 由图9可知，柠檬苦素衍生物f4下调LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW26.47细胞中JNK和p38MAPK的磷酸化水平，表明MAPK参与了柠檬苦素衍生物f4的抗炎过程。
[0151] 实验例7
[0152] 体重20±2g的6?8周的雄性C57BL小鼠(购自长春宜思实验动物技术有限公司(中国长春))。在开始实验前，将小鼠在无菌区域，以12:12h的光照/黑暗周期饲养，并自由获取食物和水。将56只雄性小鼠随机分为七组，分别为：对照组(CON)、ALI组、f4(5mg/kg)组、f4(10mg/kg)组、f4(20mg/kg)组、LIM组和CEL组。
[0153] 分别对f4(5mg/kg)组、f4(10mg/kg)组、f4(20mg/kg)组、LIM组和CEL组的小鼠口服给药三天，分别给予5mg/kg柠檬苦素衍生物f4、10mg/kg柠檬苦素衍生物f4、20mg/kg柠檬苦素衍生物f4、20mg/kg柠檬苦素和10mg/kg塞来昔布，使ALI组、f4(5mg/kg)组、f4(10mg/kg)组、f4(20mg/kg)组、LIM组和CEL组的小鼠LPS(2.5mg/kg)口咽抽吸6h。将各组小鼠用水合氯醛进行安乐死。
[0154] 7.1组织病理学
[0155] 收集小鼠的肺并将其固定在4％多聚甲醛中，脱水，包埋在石蜡中，切片(厚度为4μm)，并用苏木精和曙红染色。显微镜下观察结构，如图10所示。
[0156] 小鼠的损伤评分通过imageproplus6.0测量。
[0157] 如图10?11所示，柠檬苦素衍生物f4能够以显著减轻LPS引起的炎症细胞浸润和肺泡出血。柠檬苦素衍生物f4以浓度依赖的方式保护了肺组织，可显著改善LPS诱导的病理变化。
[0158] 7.2肺干重比的测定
[0159] 计算湿/干重量比(W/D比)以评估肺组织水肿指数。切下肺组织并立即称重以记录为湿重。将肺组织在60℃，加热72小时，称重以记录为干重。
[0160] 如图12所示，与对照组相比LPS显著增加了肺的湿/干重量比，采用柠檬苦素衍生物f4进行预处理能够显著降低肺的湿/干重量比。
[0161] 7.3细胞因子和NO的测定
[0162] 收集小鼠支气管肺泡洗液(BALF)和血清。BALF采用如下方法收集：用1ml的0.01MPBS通过气管套管进行三次洗肺，将合并的BALF收集在冰上，在4℃下以3000rpm离心5min。
[0163] 通过ELISA试剂盒(BioLegend)按照制造商的规程测试BALF和血清中的炎性细胞因子TNF?a和IL?6的含量。
[0164] 使用Griess分析法检测NO的产生。
[0165] 如图13所示，柠檬苦素衍生物f4、柠檬苦素和塞来昔布进行预处理显着抑制TNF?α，IL?6和NO的产生，并且柠檬苦素衍生物f4的抑制作用强于柠檬苦素和塞来昔布。
[0166] 7.4蛋白印迹分析
[0167] 将肺组织在400μLRIPA细胞裂解缓冲液(含PMSF和磷酸酶抑制剂，中国Beyotime)中裂解，并在冰上孵育20分钟。然后将细胞裂解液在4℃下以13,000g离心10分钟以获得细胞溶质级分。通过BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime，中国)测定蛋白质浓度。蛋白质样品在8％?12％SDS?PAGE上电泳，然后转移至PVDF膜(GEHealthcare，UK)。印迹的膜与特定的一抗iNOS，COX?2，p?IκBa，IκBa，p?NF?кBp65，NF?кBp65，p38，p?p38，JNK，p?JNK(CST)在4℃孵育过夜。将膜在TBST(Beyotime，中国)中洗涤3次，在室温下与1：5000稀释的HRP缀合的二抗一起孵育1小时。所得结果如图14?15所示。

[0168] 如图14所示，柠檬苦素衍生物f4以剂量依赖的方式显著抑制LPS诱导的ALI中iNOS和COX?2的表达。
[0169] 如图15所示，柠檬苦素衍生物f4以剂量依赖的方式显著抑制LPS诱导的IκB磷酸化。结果表明，柠檬苦素衍生物F4可以通过NF?κB信号传导途径改善ALI。
[0170] 实验例8
[0171] 斑马鱼(Daniorerio，AB品系)饲养在循环水产养殖系统(北京爱生开云优惠体育网页版入口有限公司)中，以明暗循环(14h：10h)饲养，并保持在28.5℃±1℃。含有5mMNaCl，0.17mMKCl，0.4mMCaCl2和0.16mMMgSO4的水(以下称为“ZR溶液”)饲养斑马鱼。将柠檬苦素衍生物f4、柠檬苦素和塞来昔布分别溶解于浓度为0.2wt％的DMSO溶液中。在5ml含药ZR溶液中，将
4hpf的胚胎以大约10个幼虫/孔分配到6孔板中。暴露后将胚胎暴露于浓度为50μM、100μM、
250μM和500μM的柠檬苦素衍生物f4溶液和柠檬苦素溶液，塞来昔布溶液以5μM、10μM、25μM和50μM的浓度暴露120小时。使用0.2％DMSO作为对照，以匹配治疗中使用的最高DMSO浓度。
每24小时更换一次水(含有药物)。为了不污染存活的胚胎，去除了死亡的胚胎。进行了三个平行重复。每天监测胚胎及其发育。所得结果如图16所示。

[0172] 由图16A?C可知，在500μM柠檬苦素衍生物f4暴露下120hpf的存活率降至80％；在250μM柠檬苦素暴露下48hpf的存活率降至80％，在500μM柠檬苦素暴露下24hpf的存活率降至80％；在50μM塞来昔布暴露下24hpf的存活率降至10％。柠檬苦素衍生物f4，柠檬苦素和塞来昔布在120hpf下的LC50分别为1.453mM，0.674mM和0.034mM。图16D为72hpf时，心率与药物浓度的关系，由图16D可知，20μM塞来昔布组72hpf时与对照组相比心率明显减少。由此可知，柠檬苦素衍生物f4的毒性小于柠檬苦素和塞来昔布。

[0173] 本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

专利地区：内蒙古

专利申请日期：2021-06-24

专利公开日期：2023-12-12

专利公告号：CN115521323B